6.1 Ingegneria genetica, principi, possibilità. Aree di applicazione degli agenti biologici ottenuti con metodi di ingegneria genetica

Quando si ottimizza qualsiasi processo biotecnologico che coinvolge organismi viventi, gli sforzi principali sono solitamente volti a migliorarli proprietà genetiche. Tradizionalmente, per questi scopi veniva utilizzata la mutagenesi, seguita dallo screening e dalla selezione di varianti adeguate. Oggi in questo settore si sono verificati enormi cambiamenti. Attualmente vengono sviluppati e applicati metodi fondamentalmente nuovi basati sulla tecnologia del DNA ricombinante. La modifica del materiale genetico viene effettuata con metodi diversi: rispettivamente in un organismo vivente (in vivo) e al di fuori di esso (in vitro), queste sono due direzioni: ingegneria cellulare

riya e l'ingegneria genetica.

Utilizzando questi metodi è possibile ottenere nuovi produttori altamente produttivi di proteine ​​​​e peptidi umani, antigeni, virus, ecc. Lo sviluppo dell'ingegneria genetica e cellulare porta al fatto che l'industria biotecnologica conquista sempre più nuove aree di produzione. La base per l'emergere dei più recenti metodi di biotecnologia sono state le scoperte nel campo della genetica, biologia molecolare, enzimologia genetica, virologia, microbiologia e altre discipline.

La rapida introduzione nella pratica dei più recenti progressi fondamentali e il significativo impatto di questi ultimi sul livello della ricerca teorica inerente alla biotecnologia sono chiaramente dimostrati dallo sviluppo dell'ingegneria genetica.

La tappa più importante nello sviluppo della biotecnologia è stata la separazione della biologia molecolare in una disciplina indipendente, avvenuta a metà del secolo attuale. L'emergere della biologia molecolare è diventato possibile grazie all'interazione di genetica, fisica, chimica, biologia, matematica, ecc. E. Chargoff e Z. D. Hotchkiss, studiando le relazioni molecolari delle basi nucleotidiche nel DNA (adenina, guanina, citosina, timina) hanno mostrato che in vari organismi sono gli stessi. Questa scoperta ha svolto un ruolo chiave nello stabilire la struttura del DNA. I progressi nel campo della genetica dei batteri e dei batteriofagi hanno svolto un ruolo importante nella decifrazione della struttura del DNA. È stato stabilito (A. Hershey, M. Chase, J. Lederberg, N. Zinder) che trasduce-

zione (trasferimento di materiale genetico) può essere effettuato con l'aiuto di un batteriofago e il DNA dei fagi può svolgere il ruolo di portatore di ereditarietà. B. Hayes ha anche chiarito gli schemi del processo sessuale nei batteri(coniugazione) , in cui dalle cellule donatrici aventi Fattore F (fertilità), il materiale genetico viene trasferito al ricevente

cellule ent. J. Watson e F. Crick hanno proposto un modello complementare della struttura del DNA e del meccanismo della sua replicazione; È stata scoperta una proprietà unica del DNA: la capacità di auto-riproduzione (replicazione).

Basato sulla biologia molecolare e sulla genetica dei microrganismi, all'inizio degli anni '60. si formò la genetica molecolare. G. Gamow nel 1954 avanzò l'ipotesi che ciascun codone (una sequenza di nucleotidi che codifica per un amminoacido) dovrebbe essere costituito da tre nucleotidi. Nel 1961 fu confermato sperimentalmente che la struttura primaria di una proteina è codificata nel DNA come una sequenza di triplette nucleotidiche (codoni), ciascuna delle quali corrisponde a uno dei 20 amminoacidi. Nel 1966 è stato possibile ottenere dati sulla struttura codice genetico.

La domanda successiva riguardava il modo in cui le informazioni vengono trasferite dal DNA situato nel nucleo al citoplasma, dove avviene la sintesi proteica sui ribosomi. Si è scoperto che la sequenza di codoni tripletti è immagazzinata nel DNA trascritto(riscritto) in molecole di breve durata di in-

RNA formazionale (mRNA). Questo stadio DNA → mRNA era chiamato trans-

trascrizione e mRNA → stadio proteico – traduzione . Il trasferimento di un amminoacido e la determinazione della sua posizione nella molecola proteica sintetizzata vengono effettuati mediante RNA di trasferimento (tRNA) . L'RNA è sintetizzato sul DNA, come matrice, e le proteine ​​sono sintetizzate sull'RNA. Alcuni virus mancano del primo collegamento e l’RNA funge da materiale ereditario per loro.

Meccanismo di controllo dell'attività dei geni per molto tempo rimasto sconosciuto. Grande importanza ha avuto il lavoro di F. Jacob e J. Monod, che ha dimostrato che i batteri hanno geni strutturali, fornendo informazioni sulla sintesi di alcune proteine ​​e geni regolatori che attivano o disattivano i singoli geni o i loro blocchi. Si è inoltre scoperto che la regolazione genetica secondo questo principio avviene anche in altri organismi. Esistono anche altri meccanismi di regolamentazione.

Il passo successivo importante è stato quello di svolgere il lavoro sulla decifrazione delle sequenze nucleotidiche (sequenza), che fornisce informazioni sulla struttura primaria di una regione del genoma che svolge determinate funzioni. La struttura e le funzioni hanno acquisito un'espressione biologica molecolare generale; la sua essenza sta nel fatto che gli stati funzionali esprimono cambiamenti strutturali nelle macromolecole e nelle associazioni.

Dallo studio dei modelli di funzionamento del materiale genetico in una cellula, i ricercatori sono presto passati alla manipolazione genetica. È emersa una nuova tecnologia sperimentale che prevede l’introduzione di geni estranei nelle cellule. I nomi “ingegneria genetica (o genetica)” o “lavorare con il DNA ricombinante” sono equivalenti. L'essenza di questa tecnologia

la logica è nella riunificazione di frammenti di DNA in vitro con conseguente

introduzione generale di nuove strutture genetiche (“ricombinanti”) in una cellula vivente.

Nel 1972, Berg e i suoi colleghi crearono la prima molecola di DNA ricombinante, costituita da un frammento di DNA del virus OB40 e da un batteriofago

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

6.1 Ingegneria genetica, principi, possibilità. Aree applicative biologico. agenti ottenuti con metodi genetici. ingegneria

λ dvgal con operone del galattosio Escherichia coli. Due gruppi di enzimi sono diventati strumenti per la progettazione genetica: endonucleasi di restrizione (enzimi di restrizione) e ligasi. I primi sono necessari per ottenerne uno

frammenti di DNA nativo, il secondo - per la loro connessione. Gli enzimi di restrizione e le ligasi, insieme ad altri enzimi (nucleasi, trascrittasi inversa, DNA polimerasi, ecc.) assicurano tutte le manipolazioni di ingegneria genetica.

Il plasmide di E. coli viene scisso da un enzima di restrizione in entrambe le parti del DNA per formare nucleotidi spaiati (TTAA o AATT) alle estremità. Il gene viene tagliato utilizzando lo stesso enzima di restrizione con la formazione di sequenze (AATT e TTAA) alle estremità complementari al plasmide. Entrambi i DNA (gene e plasmide) sono collegati utilizzando la ligasi. Il plasmide ibrido viene introdotto nell'E. coli, che dopo la riproduzione forma un clone, tutte le cellule del quale contengono il plasmide ricombinante e il gene estraneo. Il gene viene clonato in una cellula batterica e induce in essa la sintesi proteica.

La tecnica di ingegneria genetica in vitro comprende diverse procedure sequenziali (diapositiva):

- ottenere il gene desiderato;

- la sua integrazione in un elemento genetico capace di replicarsi (vettore);

- introduzione del gene incluso nel vettore in organismo ricevente;

- identificazione (screening) e selezione delle cellule che hanno acquisito il gene o i geni desiderati.

Ottenere i geni. I geni possono essere ottenuti in diversi modi: isolamento dal DNA, sintesi chimico-enzimatica e sintesi enzimatica.

Isolare i geni dal DNA effettuato utilizzando enzimi di restrizione che catalizzano la scissione del DNA in aree che hanno determinate sequenze nucleotidiche (4-7 coppie nucleotidiche). La scissione può essere effettuata nel mezzo di una regione riconoscibile di coppie di nucleotidi; in questo caso entrambi i filamenti di DNA vengono “tagliati” allo stesso livello. I frammenti di DNA risultanti hanno le cosiddette estremità smussate. La scissione del DNA è possibile con uno spostamento, con uno dei filamenti che sporge da diversi nucleotidi. Le estremità “appiccicose” formate in questo caso, per la loro complementarità, interagiscono.

Una sequenza nucleotidica con estremità appiccicose può essere attaccata a un vettore (pretrattato con lo stesso enzima di restrizione) e convertita in una sequenza circolare come risultato della reticolazione di estremità reciprocamente complementari con ligasi. Il metodo presenta notevoli inconvenienti, poiché è piuttosto difficile selezionare l'azione degli enzimi per isolare rigorosamente il gene desiderato. Insieme al gene, vengono catturati nucleotidi "extra" o, al contrario, gli enzimi tagliano parte del gene, trasformandolo in uno funzionalmente difettoso.

Chimico-enzimatico La sintesi viene utilizzata se è nota la struttura primaria della proteina o del peptide di cui il gene codifica la sintesi. È necessaria la piena conoscenza della sequenza nucleotidica del gene. Questo metodo consente

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

6.1 Ingegneria genetica, principi, possibilità. Aree applicative biologico. agenti ottenuti con metodi genetici. ingegneria

ricreare accuratamente la sequenza nucleotidica desiderata e anche entrare

geni, siti di riconoscimento per enzimi di restrizione, sequenze regolatrici, ecc. Il metodo consiste nella sintesi chimica di frammenti di DNA a filamento singolo (oligonucleotidi) dovuta alla formazione graduale di legami esterei tra nucleotidi, solitamente 8-16 unità. Attualmente esistono “macchine genetiche” che, sotto il controllo di un microprocessore, sintetizzano molto rapidamente brevi sequenze specifiche di DNA a filamento singolo. La diapositiva mostra uno schema di una macchina del genere, progettata dalla società canadese Bio Logics. La sequenza di basi desiderata viene inserita sulla tastiera. Il microprocessore apre le valvole attraverso le quali i nucleotidi, nonché i reagenti e i solventi necessari, vengono forniti in sequenza alla colonna di sintesi utilizzando una pompa. La colonna è riempita di perline di silicio su cui sono raccolte le molecole di DNA. Questo dispositivo può sintetizzare catene lunghe fino a 40 nucleotidi alla velocità di 1 nucleotide in 30 minuti. Gli oligonucleotidi risultanti vengono reticolati tra loro utilizzando la DNA ligasi per formare un nucleotide a doppio filamento. Utilizzando questo metodo sono stati ottenuti i geni per le catene A e B dell'insulina, della proinsulina, della somatostatina, ecc.

Sintesi genica enzimatica basata su isolati RNA messaggero

(mRNA) è attualmente il metodo più comune. Innanzitutto, dalle cellule vengono isolati gli RNA messaggeri, tra cui c'è l'mRNA codificato dal gene che deve essere isolato. Quindi, in condizioni selezionate, sull'mRNA isolato dalla cellula, come su una matrice, utilizzando trascrittasi inversa (revertasi) viene sintetizzato un filamento di DNA complementare all'mRNA (cDNA). Ricevuto DNA complementare(cDNA) funge da modello per la sintesi del secondo filamento di DNA utilizzando la DNA polimerasi o reverseasi. Il primer in questo caso è un oligonucleotide complementare all’estremità 3’ dell’mRNA; un nuovo filamento di DNA si forma da deossinucleosidi trifosfati in presenza di ioni magnesio. Il metodo è stato utilizzato con grande successo per ottenere il gene dell’ormone della crescita umano (somatotropina) nel 1979.

Il gene ottenuto in un modo o nell'altro contiene informazioni sulla struttura della proteina, ma non può implementarla da solo. Pertanto, sono necessari ulteriori meccanismi per controllare l’azione del gene.

Il trasferimento dell'informazione genetica nella cellula ricevente viene effettuato come parte di un vettore. Un vettore è, di regola, una molecola di DNA circolare capace di replicarsi in modo indipendente. Il gene insieme al vettore forma il DNA ricombinante.

Costruzione del DNA ricombinante. Con la normale amministrazione

Il DNA delle cellule batteriche è soggetto ad un attacco enzimatico, a seguito del quale viene distrutto. Per evitare che ciò accada, vengono utilizzate molecole di DNA vettore che, una volta introdotte in una cellula, possono esistere autonomamente e replicarsi quando la cellula si divide. Il vettore contiene anche un tratto genetico necessario per il successivo riconoscimento e selezione degli organismi transgenici. I geni della resistenza agli antibiotici vengono solitamente utilizzati come geni marcatori.

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

6.1 Ingegneria genetica, principi, possibilità. Aree applicative biologico. agenti ottenuti con metodi genetici. ingegneria

La costruzione del DNA ricombinante viene effettuata in vitro con DNA isolato utilizzando endonucleasi di restrizione, che scindono il vettore in un sito, convertendolo da una forma circolare a lineare con formazione di estremità appiccicose complementari alle estremità del DNA di input. Le estremità complementari del vettore e del gene introdotto sono unite dalla ligasi. Il DNA ricombinante risultante viene chiuso utilizzando la stessa DNA ligasi per formare una molecola circolare.

Come vettori vengono utilizzati plasmidi e virus. I virus vengono trasportati da una cellula all’altra e possono infettare rapidamente l’intero corpo in breve tempo. Un problema importante quando si utilizzano è l'attenuazione (indebolimento della patogenicità per l'ospite); pertanto, non è ovvio che le cellule infettate dal virus sopravvivano e siano in grado di trasmettere il programma genetico alterato alla prole. I vettori più comuni sono i plasmidi multicopia con un peso molecolare di 3–10 kb. I primi plasmidi furono isolati dai batteri e successivamente iniziarono a essere costruiti utilizzando metodi di ingegneria genetica.

L'uso metodico di vettori generici è un compito semplice che non richiede attrezzature speciali. I vettori plasmidici più utilizzati per la clonazione sono i plasmidi di E. coli (pBR322, pBR325, pACYC117, pACYC 184), così come quelli costruiti sulla base del plasmide CoIEI. I moderni vettori plasmidici in presenza di cloramfenicolo sono in grado di replicarsi, indipendentemente dalla divisione cromosomica, il numero di copie plasmidiche può aumentare fino a 1–2.103 copie per cellula;

Quando si ottiene una libreria di geni da piante e animali superiori, in cui la lunghezza totale del genoma arriva fino a 3109 o più, la capacità del vettore gioca spesso un ruolo decisivo. In questo caso, il DNA del fago λ viene utilizzato come vettore. Utilizzando metodi speciali, il DNA ricombinante viene introdotto direttamente nelle teste dei fagi. I plasmidi cosmidici hanno una capacità ancora maggiore (fino a 40 kb), in cui il frammento cos del genoma del fago λ è coinvolto nell'impacchettamento del DNA nella particella del fago nella fase finale dello sviluppo. Per il confezionamento del DNA, il DNA deve contenere una regione COS ed avere all'incirca le stesse dimensioni del genoma del fago. I metodi ottenuti per impacchettare il DNA in una testa fagica utilizzando i cosmidi consentono di ottenere librerie genetiche da quasi tutti gli organismi.

Trasferimento di geni nelle cellule dell'organismo ricevente. Trasferimento di ricombinante

il DNA nante viene effettuato mediante trasformazione o coniugazione. La trasformazione è il processo di modifica delle proprietà genetiche di una cellula a seguito della penetrazione di DNA estraneo al suo interno. Fu scoperto per la prima volta nei pneumococchi da F. Giffith, il quale dimostrò che alcune cellule di ceppi batterici non virulenti, quando infettano topi insieme a ceppi virulenti, acquisiscono proprietà patogene. Ulteriore

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

6.1 Ingegneria genetica, principi, possibilità. Aree applicative biologico. agenti ottenuti con metodi genetici. ingegneria

la trasformazione è stata dimostrata e studiata in varie specie batteriche.

È stato stabilito che solo poche cellule, le cosiddette cellule competenti (capaci di incorporare DNA estraneo e sintetizzare una speciale proteina trasformante), sono in grado di trasformarsi. La competenza di una cellula è determinata anche da fattori ambientali. Ciò può essere facilitato trattando le cellule con polietilenglicole o cloruro di calcio. Dopo la penetrazione nella cellula, uno dei filamenti di DNA ricombinante si degrada e l'altro, a causa della ricombinazione con una regione omologa del DNA ricevente, può essere incluso in un cromosoma o in un'unità extracromosomica. La trasformazione è il modo più universale di trasmettere informazioni genetiche e ha valore più alto per le tecnologie genetiche.

La coniugazione è uno dei metodi di scambio di materiale genetico, in cui avviene un trasferimento unidirezionale di informazioni genetiche dal donatore al ricevente. Questo trasferimento è sotto il controllo di speciali plasmidi coniugativi (fattore di fertilità). Il trasferimento delle informazioni dalla cellula donatrice alla cellula ricevente avviene attraverso speciali villi genitali (pili). È anche possibile trasferire informazioni utilizzando plasmidi non coniugativi con la partecipazione di plasmidi helper.

Il trasferimento dell'intero set di geni di un virus o di un fago, che porta allo sviluppo di particelle fagiche nella cellula, è chiamato trasfezione. La tecnica, applicata alle cellule batteriche, prevede l'ottenimento di sferoplasti, la purificazione del mezzo di incubazione dalle nucleasi e l'aggiunta di DNA fagico purificato (la presenza di solfato di protamina aumenta l'efficienza della trasfezione). La tecnica è applicabile a cellule animali e vegetali utilizzando speciali vettori virali shuttle.

Screening e selezione di cellule ricombinanti. Dopo aver trasferito il design

DNA rutato, di regola, solo una piccola parte delle cellule riceventi acquisisce il gene necessario. Pertanto, un passo molto importante è l'identificazione delle cellule che trasportano il gene bersaglio.

Nella prima fase vengono identificate e selezionate le cellule portatrici del vettore sulla base del quale viene effettuato il trasferimento del DNA. La selezione viene effettuata utilizzando marcatori genetici che contrassegnano il vettore. I marcatori principali sono i geni di resistenza agli antibiotici. Pertanto, la selezione viene effettuata seminando le cellule su terreni contenenti un antibiotico specifico. Dopo la semina su questi terreni, crescono solo le cellule che contengono un vettore con geni di resistenza agli antibiotici.

Nella seconda fase vengono selezionate le cellule che trasportano il vettore e il gene bersaglio. A tale scopo vengono utilizzati due gruppi di metodi: 1) basati sull'analisi diretta del DNA delle cellule riceventi e 2) basati sull'identificazione del tratto codificato dal gene bersaglio. Quando si utilizza il primo gruppo di metodi, il DNA vettoriale viene isolato dalle cellule che presumibilmente contengono il gene desiderato e viene effettuata una ricerca per le regioni che trasportano questo gene. Successivamente, viene sequenziata parte della sequenza nucleotidica del gene.

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

6.1 Ingegneria genetica, principi, possibilità. Aree applicative biologico. agenti ottenuti con metodi genetici. ingegneria

È possibile un altro metodo: l'ibridazione del DNA isolato dalle cellule con una sonda (il gene desiderato o il suo mRNA corrispondente); Il DNA isolato viene convertito in uno stato a filamento singolo e interagisce con la sonda. Successivamente, viene determinata la presenza di molecole di DNA ibride a doppio filamento. Nella seconda opzione, è possibile selezionare direttamente le cellule che sintetizzano la proteina, il prodotto della trascrizione e della traduzione del gene bersaglio. Vengono utilizzati anche terreni selettivi che supportano la crescita delle sole cellule che hanno acquisito il gene bersaglio.

Utilizzando metodi di ingegneria genetica, è possibile costruire nuove forme di microrganismi secondo un determinato piano, in grado di sintetizzare una varietà di prodotti, compresi gli organismi eucarioti. Le cellule microbiche ricombinanti si moltiplicano rapidamente in condizioni controllate e sono in grado di utilizzare una varietà di substrati, compresi quelli poco costosi.

I principali problemi che sorgono durante la manipolazione genetica sono i seguenti: 1) durante la trasformazione, i geni che entrano in un ambiente estraneo sono esposti alle proteasi, quindi devono essere protetti; 2) di norma, il prodotto del gene trapiantato si accumula nelle cellule e non viene rilasciato nell'ambiente; 3) i tratti più desiderabili sono codificati non da uno, ma da un gruppo di geni. Tutto ciò complica notevolmente il trasferimento e richiede lo sviluppo della tecnologia per il trapianto sequenziale di ciascun gene.

Ad oggi, l'ingegneria genetica ha dominato tutti i regni viventi. L'espressione fenotipica di geni “estranei” (espressione) è stata ottenuta in batteri, lieviti, funghi, piante e animali. Brillanti successi sono stati ottenuti sulle cellule dei microrganismi più studiati. L’era del DNA ricombinante nelle piante e negli animali superiori è appena iniziata. Nel campo dell'ingegneria genetica degli animali, la clonazione

geni della β-globina di topo, fago λ. Oltre alle cellule renali delle scimmie verdi africane, vengono testati nuovi tipi di colture cellulari animali, comprese le cellule umane. Ad esempio, nelle cellule di falena zingara utilizzando un vettore virale, è stato possibile ottenere l'espressione del gene dell'interferone β umano. Questo gene è stato clonato anche in cellule di mammifero. Nell'ingegneria genetica umana, come nell'ingegneria genetica delle piante, non è stata ancora raggiunta l'espressione genica tessuto-specifica. Le soluzioni a questo problema vengono cercate introducendo alcune regioni regolatrici del promotore nei vettori costruiti. La possibilità di migliorare le razze animali da allevamento rimane un compito piuttosto lontano. Ad oggi non ci sono praticamente informazioni sulla genetica di caratteristiche come fertilità, produzione di latte e contenuto di grassi, maggiore resistenza alle malattie, ecc. Ciò ostacola i tentativi di manipolazione genetica in questo settore.

L'ingegneria genetica non solo mette nelle mani dei biotecnologi nuovi produttori di composti preziosi, ma migliora e aumenta anche l'efficienza delle proprietà preziose di organismi già utilizzati tradizionalmente. Comune

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

6.1 Ingegneria genetica, principi, possibilità. Aree applicative biologico. agenti ottenuti con metodi genetici. ingegneria

Uno dei metodi migliori per aumentare la resa del prodotto utile è l'amplificazione

zione – aumento del numero di copie del gene . L’educazione di molti professionisti target

prodotti (amminoacidi, vitamine, antibiotici, ecc.) è caratterizzato da un lungo percorso di sintesi biochimica, controllato non da uno, ma da dozzine di geni. L'isolamento di questi geni e la clonazione mediante amplificazione è un compito piuttosto difficile, ma in alcuni casi possibile. Un aumento della resa del prodotto utile si ottiene anche utilizzando il locale

mutagenesi lisata (sito specifica) in vitro : mediante la mutagenesi chimica non viene elaborato l'intero genoma della cellula, ma un suo frammento ottenuto mediante restrizione.

6.2 Tecnologie per la progettazione genetica di organismi in vitro. Sorgenti di DNA per il clonaggio genico (restrizione, sintesi genica enzimatica e chimico-enzimatica).

Metodi per l'introduzione del DNA. Espressione dei geni nel DNA ricombinante. Ingegneria genetica di importanti produttori industrialmente di insulina, somatotropina, interferoni

Lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante rende possibile isolare i geni eucariotici e esprimerli in sistemi eterologhi. Attualmente, i metodi di ingegneria genetica consentono di costruire sistemi genetici in grado di funzionare nelle cellule procariotiche ed eucariotiche. Queste capacità vengono utilizzate per creare organismi con nuove proprietà preziose, ad esempio ceppi batterici in grado di sintetizzare proteine ​​eucariotiche.

Tra i prodotti proteici di grande interesse ci sono le sostanze biologicamente attive come gli ormoni. Tra questi un posto importante è occupato dagli ormoni proteici e peptidici. Questi ormoni, molti dei quali sono urgentemente necessari in medicina, fino a poco tempo fa venivano ottenuti mediante estrazione da tessuti animali, a condizione che l'ormone non avesse una pronunciata specificità della specie. Sono stati fatti tentativi per ottenere ormoni peptidici relativamente corti mediante sintesi chimica. Ma questo metodo di produzione si è rivelato non redditizio anche per molecole costituite da diverse dozzine di unità. L'unica fonte di ormoni con specificità di specie estremamente pronunciata (ormone della crescita somatotropina) erano gli organi di persone decedute.

I progressi nell'ingegneria genetica hanno fatto sperare nella possibilità di clonare geni per la sintesi di numerosi ormoni nelle cellule microbiche. Queste speranze erano in gran parte giustificate, innanzitutto, dall'esempio della sintesi microbiologica degli ormoni peptidici.

I primi risultati positivi sull'espressione di una sequenza nucleotidica di DNA sintetizzata chimicamente che codifica l'ormone peptidico 14-mer somatostatina (antagonista della somatotropina) furono ottenuti nel 1977 negli Stati Uniti dalla società Genetek. Per impedire il processo di distruzione

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

Per studiare l'ormone nelle cellule batteriche sotto l'influenza della peptidasi, gli autori hanno utilizzato un approccio che è stato successivamente utilizzato con successo per ottenere altri ormoni peptidici. È stato costruito un gene ibrido, parte del quale è stato preso dal gene dell'enzima β-galattosidasi dell'Escherichia coli, e il resto era un frammento che codificava la somatostatina stessa (il frammento è stato sintetizzato chimicamente). Entrato cellule batteriche il gene ibrido dirigeva la sintesi di una proteina chimera costituita da oltre il 90% della sequenza aminoacidica della β-galattosidasi. Il resto era somatostatina. Alla giunzione della regione dei due geni originali c'era un codone per l'aminoacido metionina. Quest'ultimo ha permesso di trattare la proteina ibrida con bromuro di cianogeno, che rompe il legame peptidico formato dalla metionina; tra i prodotti della degradazione è stata trovata la somatostatina. Questo approccio è stato utilizzato per ottenere molti ormoni peptidici (catene A e B dell'insulina, neuropeptide lehenkephalin, bradichinina, angiotensina, ecc.).

Utilizzando metodi di ingegneria genetica, sono stati creati in un breve periodo di tempo microrganismi superproduttori, consentendo di ottenere numerose proteine ​​virali e animali in quantità elevate. Sono stati creati ceppi in cui fino al 20% della proteina cellulare è costituita da prodotti geneticamente modificati, ad esempio l'antigene bovino del virus dell'epatite B, il principale antigene capside del virus dell'afta epizootica, la renina di vitello, l'antigene di superficie del virus dell’epatite B, ecc.

Preparazione dell'insulina ricombinante. L'ormone insulina è costituito da due catene polipeptidiche, A e B, lunghe rispettivamente 20 e 30 aminoacidi. La sequenza dei circuiti fu stabilita nel 1955 da Sanger. La sintesi di entrambe le catene, comprese 170 reazioni chimiche, fu realizzata negli Stati Uniti, in Germania e in Cina nel 1963. Ma si è rivelato impossibile trasferire un processo così complesso all’industria. Fino al 1980 l'insulina veniva ottenuta isolandola dal pancreas (il pancreas di una mucca pesa 200–250 g, e per ottenere 100 g di insulina cristallina sono necessari fino a 1 kg di materia prima). Pertanto, le sue esigenze non erano completamente soddisfatte. Pertanto, nel 1979, su 6 milioni di pazienti registrati con diabete, solo 4 milioni di persone ricevevano insulina. Nel 1980, la società danese Novo Industry ha sviluppato un metodo per convertire l’insulina suina in insulina umana mediante sostituzione enzimatica del residuo di alanina, che viene 30 amminoacido della catena B, al residuo di treonina. Di conseguenza, è stata ottenuta l'insulina umana monocomponente 99% pulizia. Nel corpo dell'animale, due catene polipeptidiche sono inizialmente parti di una molecola proteica lunga 109 aminoacidi: questa è la preproinsulina. Quando sintetizzati nelle cellule pancreatiche, i primi 23 aminoacidi fungono da segnale per il trasporto della molecola attraverso la membrana cellulare. Questi amminoacidi vengono scissi per formare la proinsulina, che è lunga 86 amminoacidi.

Nel 1980, Gilbert e colleghi isolarono l'mRNA dell'insulina da un tumore a cellule β del pancreas di ratto (a quel tempo la manipolazione non era consentita).

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

6.2 Tecnologie per la progettazione genetica di organismi nvitro. Fonti di DNA per la clonazione genetica. Metodi di iniezione del DNA...

essere influenzati dai geni umani). La copia risultante del DNA dell'mRNA è stata inserita nel plasmide pBR 322, in Parte di mezzo gene della penicillinasi (l'enzima viene normalmente rilasciato dalla cellula), che è stato trasportato nel batterio. Si è scoperto che il plasmide costruito conteneva informazioni sulla struttura della proinsulina e non della preproinsulina. Durante la traduzione dell'mRNA nelle cellule di E. coli, è stata sintetizzata una proteina ibrida contenente sequenze di penicillinasi e proinsulina. L'ormone di questa proteina è stato scisso con la trypsin. È stato dimostrato che la proteina così ottenuta influenza il metabolismo degli zuccheri in modo simile all'ormone pancreatico. Nel 1979, negli Stati Uniti, i geni che codificavano per le catene A e B dell'insulina furono sintetizzati entro tre mesi; i geni sono stati assemblati rispettivamente da 18 e 11 oligonucleotidi. Successivamente, i geni sono stati inseriti, come nella produzione della somatostatina, in un plasmide all'estremità del gene della β-galattosidasi di Escherichia coli.

Nelle cellule di E. coli viene sintetizzata anche la proinsulina e non solo le sue singole catene. Una copia del DNA è stata sintetizzata dall'mRNA modello isolato. La sintesi della proinsulina presenta alcuni vantaggi, poiché le procedure per l'estrazione e la purificazione dell'ormone sono minime.

Il miglioramento della tecnologia per ottenere ceppi produttori geneticamente modificati mediante varie tecniche (amplificazione del plasmide, incapsulamento del DNA ricombinante introdotto, soppressione dell'attività proteolitica delle cellule riceventi) ha permesso di ottenere rese elevate dell'ormone, fino a 200 mg/l di coltura . Test medici, biologici e clinici della proteina geneticamente modificata hanno dimostrato l'idoneità del farmaco e nel 1982 ne è stata approvata la produzione in molti paesi.

Biosintesi della somatotropina. La somatotropina (ormone della crescita ipofisario) fu isolata per la prima volta nel 1963 da materiale cadaverico. La produzione ormonale di una ghiandola pituitaria ammontava a circa 4-6 mg in termini di preparato farmaceutico finito. Per il trattamento del nanismo, la dose richiesta è di 6 mg a settimana per un anno. Oltre alla mancanza di massa, il farmaco ottenuto mediante estrazione era eterogeneo e contro di esso venivano prodotti anticorpi che annullavano l'effetto dell'ormone; Inoltre, esisteva il pericolo che durante l'assunzione del farmaco il corpo potesse essere infettato da virus a sviluppo lento. Pertanto, i bambini che ricevono questo farmaco hanno richiesto molti anni di controllo medico.

Il farmaco geneticamente modificato presenta indubbi vantaggi: è disponibile in grandi quantità, omogeneo, non contiene virus. La sintesi della somatotropina, costituita da 191 residui aminoacidici, è stata effettuata negli Stati Uniti da Goeddel e collaboratori nel 1979 (società Genentek).

La sintesi chimico-enzimatica del DNA produce un gene che codifica per un precursore della somatotropina, pertanto è stata scelta una via di clonazione speciale. Nella prima fase, è stata clonata una copia di DNA a doppio filamento dell'mRNA e, mediante digestione di restrizione, è stata ottenuta una sequenza che codifica l'intera sequenza aminoacidica dell'ormone, ad eccezione dei primi 23 aminoacidi. Successivamente è stato clonato un polinucleotide sintetico corrispondente a questi 23 amminoacidi con il codone di inizio ANG all'inizio. Due hanno ricevuto-

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

6.2 Tecnologie per la progettazione genetica di organismi nvitro. Fonti di DNA per la clonazione genetica. Metodi di iniezione del DNA...

Questi frammenti sono stati collegati e adattati a una coppia di promotori lac e a un sito di legame ribosomiale. Il gene ingegnerizzato è stato trapiantato in E. coli. L'ormone sintetizzato nei batteri aveva il peso molecolare richiesto e non era associato ad alcuna proteina; la sua resa era di circa 100.000 molecole per cellula. L'ormone, tuttavia, conteneva un ulteriore residuo di metionina all'estremità N della catena polipeptidica; quando quest'ultimo veniva rimosso, la resa ormonale era bassa.

Nel 1980 è stata ottenuta la prova che la somatotropina geneticamente modificata ha l'attività biologica dell'ormone nativo. Anche gli studi clinici sul farmaco hanno avuto successo. Nel 1982 l'ormone fu ottenuto anche sulla base dell'Escherichia coli ingegnerizzato presso l'Istituto Pasteur di Parigi. Nel 1990, il costo dell’ormone era sceso a 5 dollari/unità. Attualmente viene utilizzato nell'allevamento del bestiame per stimolare la crescita del bestiame, la produzione di latte, ecc.

Ottenere interferoni. Gli interferoni sono un gruppo di proteine ​​che possono essere prodotte nelle cellule nucleari dei vertebrati. Si tratta di potenti proteine ​​inducibili che costituiscono un fattore di resistenza aspecifica che mantiene l'omeostasi dell'organismo. Il sistema dell'interferone ha una funzione regolatrice nell'organismo, poiché è in grado di modificare vari processi biochimici. Interferoni vertebrati, compresi

compreso l'uomo, sono divisi in tre gruppi: α, β, γ, rispettivamente leucociti, fibroblasti e immunitari.

Alla fine degli anni '70 divenne evidente la potenziale importanza degli interferoni in medicina, compresa la prevenzione del cancro. Gli studi clinici sono stati ostacolati dalla mancanza di quantità sufficienti di interferoni e dal costo elevato dei farmaci ottenuti in modo tradizionale (isolamento dal sangue). Così, nel 1978, un inno al ricevere

0.1 g di interferone puro nel Central Health Laboratory di Helsinki (il laboratorio è leader mondiale nella produzione di interferone da leucociti persone sane) sono stati ottenuti processando 50.000 litri di sangue. La quantità risultante del farmaco potrebbe fornire un trattamento contro l’infezione virale in 10.000 casi. Le prospettive per ottenere interferoni erano associate all'ingegneria genetica.

IN Nel 1980, Gilbert e Weissman negli Stati Uniti riuscirono a ottenere l'interferone nell'E. coli geneticamente modificato. La difficoltà iniziale che hanno incontrato sono stati i bassi livelli di mRNA nei globuli bianchi, anche quelli stimolati dall’infezione virale. Elaborando 17 litri di sangue, è stato possibile isolare l'mRNA e ottenerlo Copia del DNA. Quest'ultimo è stato inserito in un plasmide e clonato in E. coli. Sono stati testati oltre 20.000 cloni. Alcuni cloni erano in grado di sintetizzare l'interferone, ma con una resa bassa, 1–2 molecole per cellula. Studi simili sono stati condotti in Giappone, Inghilterra, Francia e Russia.

IN Sono state stabilite le sequenze nucleotidiche del 1980 Interferoni α e β: l'mRNA dell'interferone dei fibroblasti è costituito da 836 nucleotidi

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

6.2 Tecnologie per la progettazione genetica di organismi nvitro. Fonti di DNA per la clonazione genetica. Metodi di iniezione del DNA...

Dov; di questi, 72 e 203 nucleotidi si trovano nelle regioni 5' e 3' non tradotte, 63 codificano il peptide responsabile della secrezione di interferone dalle cellule e 498 nucleotidi codificano 166 residui aminoacidici dell'interferone stesso. Successivamente, i geni dell'interferone α e β sono stati ottenuti mediante sintesi chimica e clonati in E. coli. Nel 1981 fu decifrata la sequenza nucleotidica dell'interferone immunitario, significativamente diversa dalle prime due, ma comparabile per dimensioni della molecola. Un punto significativo è stata la sintesi completa del gene dell'interferone dei leucociti umani, effettuata nel Regno Unito dai dipendenti della società Imperial Chemical Industry e della School of Biological Sciences dell'Università di Leicester. Nel giro di un anno e mezzo è stata sintetizzata la sequenza completa di una copia del DNA dell'interferone, in grado di codificare l'interferone α 1. La sintesi degli oligonucleotidi è stata effettuata con un nuovo metodo, che ha accelerato significativamente la sintesi genetica. Innanzitutto, un nucleotide è stato attaccato alla resina di poliacrilammide; Successivamente, l'aggiunta di coppie di nucleotidi è stata effettuata utilizzando un agente condensante in piridina anidra. Ogni ciclo durava un'ora e mezza, quindi nell'arco di un anno fu possibile sintetizzare una sequenza lunga 5000 nucleotidi. 67 oligonucleotidi sono stati sintetizzati e combinati utilizzando la ligasi in DNA a doppio filamento costituito da 514 coppie di nucleotidi. Il gene risultante è stato inserito nelle cellule di due batteri: E. coli,

Methylophilus methylotrophus ed è stata ottenuta l'espressione.

Gli sforzi volti a ottenere interferoni geneticamente modificati, rispetto al metodo della coltura cellulare, hanno ridotto i costi di oltre 100 volte. Vari tipi di interferoni sono stati ottenuti a partire da cellule batteriche e di lievito geneticamente modificate. Ciò ha permesso di avviare sperimentazioni biomediche e cliniche di farmaci. I preparati di interferone ottenuti nel periodo 1980-1981 erano purificati all'80% e avevano un'attività specifica di oltre 107 unità internazionali per 1 mg di proteina. L'espansione degli studi clinici sugli interferoni iniziata durante questo periodo dipende dall'aumento del grado di purificazione. Progressi in questa direzione sono stati ottenuti con l'uso di anticorpi monoclonali, che possono essere utilizzati per la cromatografia di affinità (in cui le proteine ​​desiderate vengono trattenute su una colonna con anticorpi).

6.3 Ingegneria cellulare. Produzione di agenti biologici utilizzando metodi di ingegneria cellulare in vivo. Mutagenesi.

Metodi per ottenere e isolare mutanti. Ibridazione delle cellule eucariotiche.

Plasmidi e coniugazione di batteri. Trasduzione fagica. Tecnica di fusione dei protoplasti. Ibridomi.

Preparazione e utilizzo degli anticorpi monoclonali

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

Tradizionalmente, per ottenere agenti biologici più attivi,

modificarono la selezione e la mutagenesi. La selezione è la selezione diretta dei mutanti

– organismi la cui eredità ha acquisito un brusco cambiamento a seguito di una modifica strutturale nella sequenza nucleotidica del DNA. Il percorso generale di selezione è il percorso dalla selezione cieca dei produttori desiderati alla progettazione consapevole del loro genoma. I metodi di selezione tradizionali un tempo svolgevano un ruolo importante nello sviluppo di varie tecnologie che utilizzano microrganismi. Sono stati selezionati ceppi di birra, vino, prodotti da forno, acido acetico e altri microrganismi. I limiti del metodo di selezione sono associati alla bassa frequenza di mutazioni spontanee che portano a cambiamenti nel genoma. Un gene deve raddoppiare in media 106-108 volte affinché si verifichi una mutazione.

Porta ad una significativa accelerazione del processo di selezione mutagenesi indotta(un forte aumento della frequenza delle mutazioni di un oggetto biologico dovuto al danno artificiale al genoma). Le radiazioni ultraviolette e i raggi X e una serie di composti chimici (acido nitroso, bromuracile, antibiotici, ecc.) hanno un effetto mutageno. Dopo aver trattato la popolazione con un mutageno, viene effettuato uno screening (verifica) totale dei cloni risultanti e vengono selezionati quelli più produttivi. I cloni selezionati vengono riprocessati e i cloni produttivi vengono nuovamente selezionati, ovvero viene effettuata una selezione graduale in base al tratto di interesse.

Questo lavoro richiede molto lavoro e tempo. Gli svantaggi della selezione graduale possono essere ampiamente superati combinandola con metodi di scambio genetico.

La progettazione genetica in vivo (ingegneria cellulare) comprende l'ottenimento, l'isolamento e l'utilizzo di mutanti in vari modi scambio di informazioni ereditarie delle cellule viventi

La base dell'ingegneria cellulare è la fusione di cellule non riproduttive (ibridazione delle cellule somatiche) per formare un unico insieme. La fusione cellulare può essere completa oppure la cellula ricevente può acquisire singole parti della cellula donatrice (mitocondri, citoplasma, genoma nucleare, cloroplasti, ecc.). La ricombinazione è causata da vari processi di scambio di informazioni genetiche delle cellule viventi (processi sessuali e parasessuali nelle cellule eucariotiche; coniugazione, trasformazione e trasduzione nei procarioti, nonché il metodo universale - fusione del protoplasto).

Durante l'ibridazione vengono prelevati ceppi di microrganismi geneticamente marcati (solitamente mutanti auxotrofici o mutanti resistenti agli inibitori della crescita). Come risultato della fusione cellulare (copulazione), si formano ibridi nel lievito, nei funghi e nelle alghe. Se le cellule originali erano aploidi, a seguito della fusione nucleare appare una cellula diploide (zigote), che porta un doppio corredo di cromosomi nel nucleo. In alcuni rappresentanti, il nucleo subisce immediatamente la meiosi, durante la quale ciascuno dei cromosomi viene diviso. I cromosomi omologhi formano coppie e si scambiano parti dei loro cromatidi in seguito all'incrocio. Successivamente si formano spore sessuali aploidi, ciascuna delle quali contiene un insieme di geni che distinguono le cellule madri come risultato della ricombinazione genetica

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

6.3 Ingegneria cellulare. Ricevere biologico agenti che utilizzano metodi cellulari. ingegneria in vivo. Mutagenesi. Metodi di ricezione e isolamento dei mutanti

lo stesso cromosoma, così come cromosomi diversi nella distribuzione delle coppie cromosomiche. Se dopo la fusione i nuclei non si fondono si formano forme con citoplasma misto e nuclei di diversa origine (eterocarioni). Tali forme sono caratteristiche dei funghi, in particolare dei produttori di penicillina. Quando i diploidi o eterocarioni eterozigoti risultanti si riproducono, si verifica la scissione - manifestazione nella prole, che rivela non solo le caratteristiche dominanti, ma anche quelle recessive dei genitori. I processi sessuali e parasessuali sono ampiamente utilizzati nella pratica genetica di microrganismi produttori di importanza industriale.

Nei batteri, lo scambio di informazioni genetiche avviene a seguito dell'interazione plasmidi coniugativi (coniugazione). Per la prima volta

zione è stata osservata in E. coli K-12. Per l'incrocio coniugativo, le colture del donatore e del ricevente vengono mescolate e incubate insieme in brodo nutriente o sulla superficie del terreno agarizzato. Le cellule sono collegate tra loro utilizzando il ponte di coniugazione risultante; attraverso il ponte, un sito specifico del cromosoma plasmidico viene trasferito al ricevente. Pertanto, a 37 °C, sono necessari circa 90 minuti per trasferire l'intero cromosoma. La coniugazione ha aperto e sta aprendo ampie prospettive per l'analisi genetica e la costruzione di ceppi.

La trasduzione è il processo di trasferimento delle informazioni genetiche da una cellula ricevente a una cellula donatrice utilizzando un fago . Per la prima volta questo pro-

il processo fu descritto nel 1952 da Zinder e Liederberg. La trasduzione si basa sul fatto che durante la riproduzione dei fagi nei batteri si possono formare particelle che contengono DNA fagico e frammenti di DNA batterico. Per effettuare la trasduzione è necessario moltiplicare il fago nelle cellule del ceppo donatore e poi infettare con esso le cellule riceventi. La selezione delle forme ricombinanti viene effettuata su terreni selettivi che non supportano la crescita delle forme originali.

IN negli ultimi anni è stato molto utilizzatometodo di fusione del protoplasto. Questo metodo sembra essere un modo universale per introdurre informazioni genetiche in cellule di varia origine. La semplicità del metodo lo rende accessibile per la selezione di produttori industrialmente importanti. Il metodo apre nuove possibilità per ottenere ibridi interspecifici e intergenerici e incrociare forme di esseri viventi filogeneticamente distanti. Risultati positivi sono stati ottenuti dalla fusione di cellule batteriche, di lievito e vegetali. Sono stati ottenuti ibridi di lievito interspecifici e intergenerici. Esistono prove della fusione di cellule di vari tipi di batteri e funghi. È stato possibile ottenere cellule ibride come risultato della fusione di cellule di organismi appartenenti a regni diversi: animale e vegetale. Le cellule nucleari della rana sono state fuse con i protoplasti della carota; una cellula ibrida pianta-animale cresceva su supporti cellulari vegetali, ma perdeva rapidamente il suo nucleo e si ricopriva di una parete cellulare.

IN Negli ultimi anni si è lavorato con successo per creare associazioni di cellule di organismi diversi, ovvero si ottengono colture miste di cellule di due o più organismi per creare simbiosi artificiali. Sono stati condotti con successo esperimenti sull'introduzione di un organismo che fissa l'azoto

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

6.3 Ingegneria cellulare. Ricevere biologico agenti che utilizzano metodi cellulari. ingegneria in vivo. Mutagenesi. Metodi di ricezione e isolamento dei mutanti

Anabaena variabilis nelle piante di tabacco. I tentativi di introdurre A. variabilis direttamente nelle talee di piante di tabacco mature non hanno prodotto risultati positivi. Ma con la coltivazione congiunta di tessuto mesofilo di tabacco e cianobatteri è stato possibile ottenere piante rigenerate contenenti cianobatteri. Sono state ottenute associazioni di cellule di ginseng e belladonna con cianobatteri.

la sua Chlorogleae fritschii.

La propagazione clonale di cellule animali per la manipolazione genetica è promettente. La tecnica delle colture cellulari di cellule animali per l'ottenimento di composti biologicamente attivi ha grandi prospettive, anche se è solo ai primi passi. Colture di cellule tumorali o cellule normali trasformate in vitro conservano in alcuni casi la capacità di sintetizzare prodotti specifici. Nonostante le difficoltà esistenti, è stata dimostrata la possibilità di ottenere numerose sostanze da colture cellulari animali.

Un'area importante dell'ingegneria cellulare è associata alle prime fasi embrionali. Pertanto, la fecondazione in vitro degli ovociti consente di superare l’infertilità. Con l'aiuto di iniezioni di ormoni, è possibile ottenere dozzine di ovuli da un animale, fecondarli artificialmente in vitro e impiantarli nell'utero di altri animali. Questa tecnologia viene utilizzata nella zootecnia per produrre gemelli monozigoti. È stato sviluppato un nuovo metodo basato sulla capacità delle singole cellule di un embrione precoce di svilupparsi in un feto normale. Le cellule dell'embrione vengono divise in più parti uguali e trapiantate nei riceventi. Ciò consente di riprodurre vari animali in modo accelerato. La manipolazione degli embrioni viene utilizzata per creare embrioni di vari animali. L’approccio consente di superare la barriera interspecie e creare animali chimerici. In questo modo, ad esempio, si ottenevano chimere ovicaprine.

La direzione più promettente dell'ingegneria cellulare è

Xia tecnologia dell'ibridoma. Le cellule ibride (ibridomi) si formano come risultato della fusione di cellule con programmi genetici diversi, ad esempio cellule normali differenziate e trasformate. Un brillante esempio del successo di questa tecnologia sono gli ibridomi ottenuti dalla fusione di linfociti normali e cellule di mieloma. Queste cellule ibride hanno la capacità di sintetizzare anticorpi specifici e una crescita illimitata durante la coltivazione.

A differenza della tecnica tradizionale per la produzione di anticorpi, la tecnica dell'ibridoma ha permesso per la prima volta di ottenere anticorpi monoclonali (anticorpi prodotti dai discendenti di una singola cellula). Gli anticorpi monoclonali sono altamente specifici; sono diretti contro un singolo determinante antigenico. È possibile ottenere numerosi anticorpi monoclonali per diversi determinanti antigenici, comprese macromolecole complesse.

Gli anticorpi monoclonali sono stati prodotti su scala industriale in tempi relativamente recenti. Come è noto, il normale sistema immunitario è in grado di produrre fino a un milione di tipi diversi di anticorpi in risposta ad agenti estranei (antigeni), mentre una cellula maligna sintetizza solo anticorpi di un tipo. Le cellule del mieloma si moltiplicano rapidamente. Pertanto, la cultura ottenuta

6. INGEGNERIA CELLULARE E GENETICA

6.3 Ingegneria cellulare. Ricevere biologico agenti che utilizzano metodi cellulari. ingegneria in vivo. Mutagenesi. Metodi di ricezione e isolamento dei mutanti

da una singola cellula di mieloma può essere mantenuta per un tempo molto lungo. Tuttavia, non è possibile forzare le cellule del mieloma a produrre anticorpi contro un antigene specifico. Questo problema fu risolto nel 1975 da Caesar Milstein. I dipendenti del Laboratorio di ricerca medica di biologia molecolare di Cambridge hanno avuto l'idea di unire le cellule del mieloma di topo con i linfociti B della milza di un topo immunizzato con un antigene specifico. Le cellule ibride formate a seguito della fusione acquisiscono le proprietà di entrambe le cellule madri: l'immortalità e la capacità di secernere un'enorme quantità di qualsiasi anticorpo di un certo tipo. Questi lavori furono di grande importanza e aprirono una nuova era nell'immunologia sperimentale.

Nel 1980, negli Stati Uniti, Carlo M. Croce e i suoi colleghi riuscirono a creare un ibridoma umano intraspecifico stabile, produttore di antigene, mediante fusione di linfociti B di un paziente affetto da mieloma con linfociti periferici di un paziente affetto da panencefalite subacuta.

Le fasi principali per ottenere la tecnologia dell'ibridoma sono le seguenti. I topi vengono immunizzati con l'antigene, dopo di che gli splenociti vengono isolati dalla milza, che, in presenza di polietilenglicole, vengono fusi con cellule tumorali difettose (solitamente difettose negli enzimi della via di biosintesi dei nucleotidi - ipoxantina o tiamina). Successivamente vengono selezionate su un terreno selettivo che consente la riproduzione solo alle cellule ibride. Il mezzo nutritivo con ibridomi in crescita viene testato per la presenza di anticorpi. Le colture positive vengono selezionate e clonate. I cloni vengono iniettati negli animali per formare un tumore che produce anticorpi, oppure vengono coltivati ​​in coltura. Il liquido di ascite di topo può contenere fino a 10-30 mg/ml di anticorpi monoclonali.

Gli ibridomi possono essere conservati congelati e una dose di tale clone può essere somministrata in qualsiasi momento ad un animale della stessa linea da cui sono state ottenute le cellule di fusione. Attualmente sono state create banche di anticorpi monoclonali. Gli anticorpi vengono utilizzati per una varietà di scopi diagnostici e terapeutici, compreso il trattamento antitumorale.

Un modo efficace per utilizzare gli anticorpi monoclonali in terapia è legarli a veleni citotossici. Gli anticorpi coniugati con i veleni rintracciano e distruggono le cellule tumorali di una certa specificità nel macroorganismo.

Pertanto, l'ingegneria cellulare costituisce un modo efficace per modificare gli oggetti biologici e consente di ottenere nuovi preziosi produttori a livello di organi, nonché a livello cellulare e tissutale.

Istituto statale di istruzione superiore

formazione professionale

VISU

Dipartimento di Storia e Studi Religiosi

Saggio

sul tema:

Ingegneria genetica e cellulare. Biotecnologia.

Completato da: Shipilova E.V. Gr.ZYU-110

Controllato da: Professore Associato del Dipartimento di Storia e

studi religiosi Zubkov S.A.

Vladimir 2011

1. Introduzione 3

2.Possibilità dell'ingegneria genetica . Biotecnologie 5

3.1. Agricoltura 9

3.2 Medicina e prodotti farmaceutici 11

4. Clonazione 14

4.1 Stato della ricerca terapeutica

clonazione in Russia 16

5. Problemi 17

6. Conclusione 23

Riferimenti 25

1. introduzione

L'ingegneria genetica è una direzione della ricerca nel campo della biologia molecolare e della genetica, il cui obiettivo finale è ottenere, utilizzando tecniche di laboratorio, organismi con nuove, comprese quelle non presenti in natura, combinazioni di proprietà ereditarie. L'ingegneria genetica si basa sulla possibilità di una manipolazione mirata di frammenti di acido nucleico grazie agli ultimi progressi nella biologia molecolare e nella genetica. Queste conquiste includono l’istituzione dell’universalità del codice genetico, cioè il fatto che in tutti gli organismi viventi l’inclusione degli stessi amminoacidi molecola proteica codificato dalle stesse sequenze nucleotidiche nella catena del DNA; i successi dell'enzimologia genetica, che ha fornito al ricercatore una serie di enzimi che consentono di ottenere singoli geni o frammenti di acido nucleico in forma isolata, effettuare la sintesi in vitro di frammenti di acido nucleico e combinare i frammenti risultanti in un unico insieme . Pertanto, la modifica delle proprietà ereditarie di un organismo mediante l'ingegneria genetica si riduce alla costruzione di nuovo materiale genetico da vari frammenti, introducendo questo materiale nell'organismo ricevente, creando le condizioni per il suo funzionamento e la sua eredità stabile.

All'inizio è nata l'ingegneria genetica. Anni '70 20 ° secolo L'ingegneria genetica si basa sull'estrazione di un gene (che codifica il prodotto desiderato) o di un gruppo di geni dalle cellule di un organismo e sulla loro combinazione con speciali molecole di DNA (i cosiddetti vettori) che possono penetrare nelle cellule di un altro organismo (principalmente microrganismi) e moltiplicarsi in essi, cioè creazione di molecole di DNA ricombinante.

Il DNA ricombinante (estraneo) introduce nuove proprietà genetiche e fisico-biochimiche nell'organismo ricevente. Queste proprietà includono la sintesi di aminoacidi e proteine, ormoni, enzimi, vitamine, ecc.

L'uso di metodi di ingegneria genetica apre la prospettiva di modificare una serie di proprietà dell'organismo: aumento della produttività, resistenza alle malattie, aumento del tasso di crescita, miglioramento della qualità del prodotto, ecc. Gli animali che portano un gene ricombinante (estraneo) nel loro genoma sono solitamente chiamato transgenico e un gene integrato nel genoma ricevente - transgenoma. Grazie al trasferimento genico, negli animali transgenici sorgono nuove qualità e un'ulteriore selezione consente di consolidarle nella prole e creare linee transgeniche.

I metodi di ingegneria genetica consentono di creare nuovi genotipi vegetali più velocemente dei metodi di selezione classici e diventa possibile modificare intenzionalmente la trasformazione del genotipo.

La trasformazione genetica consiste principalmente nel trasferimento di geni estranei o modificati nelle cellule eucariotiche. Nelle cellule vegetali è possibile esprimere geni trasferiti non solo da altre piante, ma anche da microrganismi e persino da animali.

Ottenere piante con nuove proprietà da cellule trasformate (rigenerazione) è possibile grazie alla loro proprietà di topitotenza, cioè la capacità delle singole cellule nel processo di realizzazione delle informazioni genetiche di svilupparsi in un intero organismo.

2. Possibilità dell'ingegneria genetica. Biotecnologia.

Attualmente, l’industria farmaceutica ha conquistato una posizione di leadership a livello mondiale, che si riflette non solo nel volume della produzione industriale, ma anche in risorse finanziarie investito in questo settore (secondo gli economisti, è entrato nel gruppo leader in termini di volume di acquisto e vendita di azioni sui mercati mobiliari). Una novità importante è stata che le aziende farmaceutiche hanno incluso nel loro ambito l'allevamento di nuove varietà di piante e animali agricoli, e spendono decine di milioni di dollari all'anno per questo, hanno anche mobilitato la produzione di prodotti chimici per l'uso quotidiano. Additivi per prodotti del settore edile e così via. Non decine di migliaia, ma forse diverse centinaia di migliaia di specialisti altamente qualificati sono impiegati nei settori industriale e di ricerca dell'industria farmaceutica, ed è in questi settori che l'interesse per la ricerca genomica e di ingegneria genetica è estremamente elevato.

Ovviamente, quindi, qualsiasi progresso nella biotecnologia vegetale dipenderà dallo sviluppo di sistemi e strumenti genetici che consentiranno una gestione più efficiente dei transgeni. La situazione è simile a quella osservata nell’industria informatica, dove oltre ad aumentare il volume delle informazioni elaborate e a migliorare i computer stessi, è necessario anche sistema operativo gestione delle informazioni, come “windows” di Microsoft.

Per asportare in modo pulito il DNA transgenico nel genoma della pianta, vengono sempre più utilizzati sistemi di ricombinazione omologa presi in prestito dalla genetica microbica, come i sistemi Cre-lox e Flp-frt. Il futuro, ovviamente, sarà quello del trasferimento genico controllato da una varietà all'altra, basato sull'utilizzo di materiale vegetale pre-preparato, che contiene già aree di omologia nei cromosomi desiderati necessarie per l'inserimento omologo del transgene. Oltre ai sistemi di espressione integrativi, verranno testati vettori che si replicano autonomamente. Di particolare interesse sono i cromosomi vegetali artificiali, che teoricamente non impongono alcuna restrizione alla quantità di informazioni teoriche introdotte.

Gli scienziati sono alla ricerca di geni che codificano nuovi tratti utili. La situazione in questo campo sta cambiando radicalmente, soprattutto grazie all’esistenza di database pubblici che contengono informazioni sulla maggior parte dei geni, batteri, lieviti, esseri umani e piante, e anche grazie allo sviluppo di metodi che consentono l’analisi simultanea dell’espressione di grandi numero di geni con un throughput molto elevato. I metodi utilizzati nella pratica possono essere suddivisi in due categorie:

1. Metodi che consentono il profilo di espressione: ibridazione per sottrazione, confronto elettronico di librerie EST, “gene chips” e così via. Permettono di stabilire una correlazione tra l'uno o l'altro tratto fenotipico e l'attività di geni specifici. 2. La clonazione posizionale consiste nel creare, mediante mutagenesi inserzionale, mutanti con disturbi in un tratto o proprietà di nostro interesse, quindi clonare il gene corrispondente come tale, che ovviamente contiene una sequenza nota (inserzione). I metodi di cui sopra non presuppongono alcuna informazione iniziale sui geni che controllano un tratto particolare. L'assenza di una componente razionale in questo caso è una circostanza positiva, poiché non è limitata dalle nostre idee attuali sulla natura e sul controllo genetico del tratto specifico che ci interessa.

Sono stati compiuti progressi significativi nel campo pratico della creazione di nuovi prodotti per l'industria medica e il trattamento delle malattie umane

Utilizzo di prodotti geneticamente modificati in medicina.

	Prodotti naturali e ambito di applicazione dei prodotti geneticamente modificati
Anticoagulanti	L'attivatore tissutale del plasminogeno (TPA) attiva la plasmina. Un enzima coinvolto nel riassorbimento dei coaguli di sangue; efficace nel trattamento di pazienti con infarto miocardico.
Fattori del sangue	Il fattore VIII accelera la formazione di coaguli; carente negli emofiliaci. L'uso del fattore VIII geneticamente modificato elimina il rischio associato alle trasfusioni di sangue.
Fattori che stimolano la formazione di colonie	Fattori di crescita del sistema immunitario che stimolano la formazione di globuli bianchi. Utilizzato per trattare l'immunodeficienza e combattere le infezioni.
eritropoietina	Stimola la formazione dei globuli rossi. Utilizzato per trattare l'anemia in pazienti con insufficienza renale.
Fattori di crescita	Stimolare la differenziazione e la crescita vari tipi cellule. Utilizzato per accelerare la guarigione delle ferite.
Ormone della crescita umano	Utilizzato nel trattamento del nanismo.
Insulina umana	Usato per trattare il diabete
Interferone	Previene la proliferazione dei virus. Utilizzato anche per trattare alcune forme di cancro.
Leixins	Attiva e stimola il lavoro di vari tipi di leucociti. Può essere utilizzato per la guarigione delle ferite, l'infezione da HIV, il cancro,
Monoclonale- nessun anticorpo	La più alta specificità associata agli anticorpi viene utilizzata per scopi diagnostici. Vengono utilizzati anche per la somministrazione mirata di farmaci, tossine, composti radioattivi e isotopici ai tumori nella terapia del cancro e ci sono molte altre aree di applicazione.
Superossido dismutasi	Previene il danno tissutale causato dai derivati ​​idrossilici reattivi in ​​condizioni di carenza di ossigeno a breve termine, soprattutto durante gli interventi chirurgici quando è necessario ripristinare improvvisamente il flusso sanguigno.
	I vaccini prodotti artificialmente (il primo è stato quello contro l’epatite B) sono sotto molti aspetti migliori dei vaccini convenzionali.

La tecnologia del DNA ricombinante si basa sulla produzione di sonde di DNA altamente specifiche, che vengono utilizzate per studiare l'espressione dei geni nei tessuti, la localizzazione dei geni sui cromosomi e identificare i geni con funzioni correlate (ad esempio, negli esseri umani e nel pollo). Le sonde del DNA vengono utilizzate anche nella diagnosi di varie malattie.

La tecnologia del DNA ricombinante ha reso possibile un approccio non convenzionale gene-proteina chiamato genetica inversa. In questo approccio, una proteina viene isolata da una cellula, il gene per questa proteina viene clonato e modificato, creando un gene mutante che codifica per una forma alterata della proteina. Il gene risultante viene introdotto nella cellula. Se viene espresso, la cellula che lo trasporta e i suoi discendenti sintetizzeranno la proteina alterata. In questo modo è possibile correggere i geni difettosi e curare le malattie ereditarie.

Se il DNA ibrido viene introdotto in un ovulo fecondato, si possono produrre organismi transgenici che esprimono il gene mutante e lo trasmettono alla prole. La trasformazione genetica degli animali consente di stabilire il ruolo dei singoli geni e dei loro prodotti proteici sia nella regolazione dell'attività di altri geni che in vari processi patologici. Con l'aiuto dell'ingegneria genetica sono state create linee di animali resistenti alle malattie virali e razze di animali con caratteristiche benefiche per l'uomo. Ad esempio, la microiniezione di DNA ricombinante contenente il gene della somatotropina bovina nello zigote di un coniglio ha permesso di ottenere un animale transgenico con iperproduzione di questo ormone. Gli animali risultanti avevano una pronunciata acromegalia.

3. Indicazioni di ingegneria genetica.

3.1 Agricoltura.

L'ingegneria genetica direttamente in agricoltura è avvenuta già alla fine degli anni '80, quando è stato possibile introdurre con successo nuovi geni in decine di specie di piante e animali - per creare piante di tabacco con foglie luminose, pomodori che tollerano facilmente il gelo, mais che è resistente ai pesticidi.

Uno dei compiti importanti dell'ingegneria genetica è ottenere piante resistenti ai virus, poiché attualmente non esistono altri modi per combattere le infezioni virali delle colture. L'introduzione dei geni della proteina dell'involucro del virus nelle cellule vegetali rende le piante resistenti a questo virus. Attualmente sono state ottenute piante transgeniche in grado di resistere agli effetti di più di una dozzina di infezioni virali diverse.

Un altro compito importante dell'ingegneria genetica è legato alla protezione delle piante dagli insetti nocivi. L'uso degli insetticidi non è sempre efficace a causa della loro tossicità e della possibilità che gli insetticidi vengano lavati via dalle piante dall'acqua piovana. Nei laboratori di ingegneria genetica del Belgio e degli Stati Uniti si è lavorato con successo per introdurre nelle cellule vegetali i geni del batterio terrestre Bacillus thuringiensis, che rendono possibile la sintesi di insetticidi di origine batterica. Questi geni furono introdotti nelle cellule di patate, pomodori e cotone, a seguito dei quali le piante transgeniche di patate e pomodori divennero resistenti allo scarabeo della patata del Colorado e le piante di cotone si rivelarono resistenti a vari insetti, incluso il verme del cotone. L'uso dell'ingegneria genetica in agricoltura ha ridotto l'uso di insetticidi del 40-60%. Gli ingegneri genetici hanno allevato piante transgeniche con un lungo periodo di maturazione dei frutti. Ciò consente di raccogliere tali pomodori dal cespuglio rosso con la certezza che non maturino troppo durante il trasporto.

L'elenco delle piante a cui sono stati applicati con successo metodi di ingegneria genetica è in aumento. Comprende meli, uva, prugne, cavoli, melanzane, cetrioli, grano, riso, soia, segale e molte altre colture.

Uno dei settori principali in cui vengono utilizzate le tecnologie dell’ingegneria genetica è l’agricoltura. Un metodo classico per migliorare la qualità dei prodotti agricoli è la selezione, un processo in cui, attraverso la selezione artificiale, singole piante o animali con determinate proprietà vengono isolate e incrociate per la trasmissione ereditaria di queste proprietà e il loro miglioramento. Questo processo è piuttosto lungo e non sempre veramente efficace. L'ingegneria genetica ha la capacità di dotare un organismo vivente di proprietà che gli sono insolite, di migliorare la manifestazione di alcune proprietà esistenti o di escluderle. Ciò avviene attraverso l'introduzione di nuovi o l'esclusione di vecchi geni dal DNA del corpo.

Ad esempio, in questo modo è stata sviluppata una varietà speciale di patate resistente allo scarabeo della patata del Colorado. Per fare questo, nel genoma della patata è stato introdotto il gene del bacillo della Turingia Bacillus thuringiensis, che produce una proteina speciale dannosa per lo scarabeo della patata del Colorado, ma innocua per l'uomo. L'uso dell'ingegneria genetica per modificare le proprietà delle piante, di regola, viene fatto proprio per aumentare la loro resistenza ai parassiti, alle condizioni ambientali sfavorevoli e migliorarne il gusto e le qualità di crescita. L'intervento sul genoma degli animali viene utilizzato per accelerarne la crescita e aumentare la produttività. In questo modo viene aumentata artificialmente anche la quantità di aminoacidi essenziali e vitamine nei prodotti agricoli, nonché il loro valore nutrizionale.

Il numero di argomenti a favore dell’utilizzo del GMF supera significativamente i possibili argomenti contrari. I sostenitori della GMF si riferiscono quindi soprattutto all'elevato livello di controllo della qualità di tutti i prodotti geneticamente modificati (GMP). Nel corso dei vent'anni di storia dell'uso di questi prodotti in diversi paesi del mondo, non è stato rivelato un solo fatto del loro impatto negativo sulla salute umana, cosa che non si può dire dei prodotti dell'agricoltura tradizionale, in cui l'uso di è inevitabile l’uso di vari tipi di fertilizzanti, molti dei quali sono riconosciuti come dannosi per l’uomo. Inoltre la selezione, utilizzata da secoli in agricoltura, mira essenzialmente alla stessa modificazione genetica degli organismi, solo che lo fa su un periodo di tempo molto più lungo. L'ingegneria genetica è semplicemente in grado di introdurre i cambiamenti necessari nel corpo in un breve periodo di tempo, e quindi l'uso dell'GMF non è più pericoloso dell'uso di qualsiasi altro prodotto generato dalla selezione classica.

Gli oppositori dell'uso dell'ingegneria genetica in agricoltura fanno appello alla mancanza di ricerche sulla sicurezza degli OGM (tuttavia, la questione continua ad essere costantemente studiata), nonché al fatto che gli OGM talvolta causano l'estinzione di alcune specie. Ad esempio, gli organismi selvatici geneticamente modificati possono spostare le popolazioni di specie selvatiche a causa della maggiore adattabilità a condizioni sfavorevoli ambiente.

3.2. Prodotti farmaceutici e medicinali.

La produzione e l'uso di vaccini contro le malattie virali hanno permesso ai medici di eliminare completamente le epidemie di peste e vaiolo, da cui in precedenza morivano milioni di persone. Il metodo dell'ingegneria genetica, a differenza di altri metodi, consente di ottenere un vaccino assolutamente innocuo (non contenente un agente infettivo). Sono inoltre in corso i lavori per produrre vaccini contro l’influenza, l’epatite e altre malattie virali umane.

I servizi dell'ingegneria genetica sono utilizzati con successo soprattutto dai farmacisti, per i quali questo metodo produce ormoni relativamente economici ma vitali, come l'insulina, l'interferone, gli ormoni della crescita e altri di natura proteica. Su richiesta dei farmacisti, gli ingegneri genetici hanno stabilito la produzione dell'ormone umano insulina (al posto dell'insulina animale precedentemente utilizzata), che svolge un ruolo importante nella lotta contro il diabete. Il metodo dell'ingegneria genetica produce anche interferone umano abbastanza economico e puro, una proteina con un effetto antivirale universale, un antigene del virus dell'epatite B.

Attualmente, l'Escherichia coli (E. coli) è diventato un fornitore di ormoni importanti come l'insulina e la somatotropina. In precedenza, l'insulina veniva ottenuta da cellule pancreatiche animali, quindi il suo costo era molto elevato. Per ottenere 100 g di insulina cristallina sono necessari 800-1000 kg di pancreas e una ghiandola di mucca pesa 200-250 grammi. Ciò ha reso l’insulina costosa e di difficile accesso per un’ampia gamma di diabetici. Nel 1978, i ricercatori della Genentech produssero per la prima volta insulina in un ceppo di Escherichia coli appositamente progettato. L'insulina è costituita da due catene polipeptidiche A e B, lunghe 20 e 30 aminoacidi. Quando sono collegati da legami disolfuro, si forma l'insulina nativa a doppia catena. È stato dimostrato che non contiene proteine ​​di E. coli, endotossine e altre impurità, non produce effetti collaterali come l'insulina animale e non è diversa da essa nell'attività biologica. Successivamente, la proinsulina è stata sintetizzata nelle cellule di E. coli, per le quali è stata sintetizzata una copia di DNA su uno stampo di RNA utilizzando la trascrittasi inversa. Dopo aver purificato la proinsulina risultante, questa è stata scissa in insulina nativa, mentre le fasi di estrazione e isolamento dell'ormone sono state ridotte al minimo. Da 1000 litri di liquido di coltura si possono ottenere fino a 200 grammi dell'ormone, che equivale alla quantità di insulina secreta da 1600 kg di pancreas di un maiale o di una mucca.

La somatotropina è un ormone della crescita umano secreto dalla ghiandola pituitaria. Una carenza di questo ormone porta al nanismo ipofisario. Se la somatotropina viene somministrata in dosi di 10 mg per kg di peso corporeo tre volte alla settimana, in un anno un bambino affetto da carenza può crescere di 6 cm. In precedenza, veniva ottenuta da materiale cadaverico, da un cadavere: 4 - 6 mg di somatotropina in termini di prodotto farmaceutico finale. Pertanto, le quantità disponibili dell'ormone erano limitate, inoltre l'ormone ottenuto con questo metodo era eterogeneo e poteva contenere virus a crescita lenta. Nel 1980, la società Genentec sviluppò una tecnologia per la produzione di somatotropina utilizzando batteri, priva di questi svantaggi. Nel 1982, l'ormone della crescita umano fu ottenuto da colture di E. coli e cellule animali presso l'Istituto Pasteur in Francia, e nel 1984 iniziò la produzione industriale di insulina nell'URSS. Nella produzione di interferone vengono utilizzati sia E. coli, S. cerevisae (lievito), sia una coltura di fibroblasti o leucociti trasformati. Anche vaccini sicuri ed economici si ottengono utilizzando metodi simili.

Uso pratico. Ora sono in grado di sintetizzare i geni e, con l'aiuto di tali geni sintetizzati introdotti nei batteri, si ottengono numerose sostanze, in particolare ormoni e interferone. La loro produzione costituiva un importante ramo della biotecnologia. L'interferone, una proteina sintetizzata dall'organismo in risposta a un'infezione virale, viene ora studiato come possibile trattamento contro il cancro e l'AIDS. Ci vorrebbero migliaia di litri di sangue umano per produrre la quantità di interferone fornita da un solo litro di coltura batterica. È chiaro che i benefici derivanti dalla produzione di massa di questa sostanza sono molto grandi. Anche l'insulina, ottenuta sulla base della sintesi microbiologica, necessaria per il trattamento del diabete, gioca un ruolo molto importante. L’ingegneria genetica è stata utilizzata anche per creare una serie di vaccini che vengono ora testati per testarne l’efficacia contro il virus dell’immunodeficienza umana (HIV), che causa l’AIDS. Con l'aiuto del DNA ricombinante, si ottiene anche l'ormone della crescita umano in quantità sufficienti, l'unico mezzo per curare una rara malattia infantile: il nanismo ipofisario. Un'altra direzione promettente in medicina associata al DNA ricombinante è la cosiddetta. terapia genetica. In questi lavori, che non sono ancora usciti dalla fase sperimentale, una copia geneticamente modificata di un gene che codifica per un potente enzima antitumorale viene introdotta nel corpo per combattere un tumore. La terapia genica ha cominciato ad essere utilizzata anche per combattere i disturbi ereditari del sistema immunitario. In agricoltura, decine di colture alimentari e foraggere sono state geneticamente modificate. Nell'allevamento degli animali, l'uso dell'ormone della crescita prodotto biotecnologicamente ha aumentato la produzione di latte; Un vaccino contro l'herpes nei maiali è stato creato utilizzando un virus geneticamente modificato.

4. Clonazione.

Le basi per l'emergere di una delle aree biomediche più promettenti nella terapia di sostituzione cellulare - la clonazione terapeutica - erano due scoperte più importanti la fine del 20° secolo. Si tratta, in primo luogo, della creazione di una pecora Dolly clonata e, in secondo luogo, della produzione di cellule staminali embrionali (ESC) ).

La clonazione è la riproduzione di un essere vivente mediante le sue cellule non riproduttive (somatiche). La clonazione di organi e di altri organi è il compito più importante nel campo della trapiantologia, della traumatologia e di altri settori della medicina e della biologia. Quando si trapiantano organi clonati, non si verificano reazioni di rigetto e non vi sono possibili conseguenze avverse (ad esempio, il cancro che si sviluppa in un contesto di immunodeficienza). Gli organi clonati sono una salvezza per le persone che hanno subito incidenti stradali o altri disastri, così come per coloro che necessitano di aiuto radicale a causa di qualsiasi malattia. La clonazione potrebbe consentire alle persone senza figli di avere figli propri e aiutare le persone affette da malattie gravi malattie genetiche. Quindi, se i geni che determinano qualsiasi malattia ereditaria sono contenuti nei cromosomi, il nucleo della sua stessa cellula somatica viene trapiantato nell'ovulo della madre, quindi apparirà un bambino, privo di geni pericolosi, una copia della madre. Se questi geni sono contenuti nei cromosomi della madre, il nucleo della cellula somatica del padre verrà trasferito nell'ovulo e bambino sano, copia del padre. L'ulteriore progresso dell'umanità è in gran parte legato allo sviluppo della biotecnologia. Allo stesso tempo, è necessario tenere conto del fatto che la diffusione incontrollata di organismi viventi e prodotti geneticamente modificati può perturbare l’equilibrio biologico della natura e rappresentare una minaccia per la salute umana.

La clonazione di un intero organismo è chiamata clonazione riproduttiva. La ricerca in questa direzione è ancora in corso, ma qualche progresso è stato fatto.

Il caso della clonazione della pecora Dolly in Gran Bretagna è ampiamente noto. Questo esperimento di clonazione di mammiferi è stato condotto da un gruppo di scienziati guidati da Jan Wilmut. Quindi i nuclei prelevati dalla mammella di un animale donatore sono stati trasferiti in 277 ovociti. Di questi si sono formati 29 embrioni, uno dei quali è sopravvissuto. Dolly è nata il 5 luglio 1996 ed è diventata il primo mammifero ad essere clonato con successo. L'animale clonato visse 6,5 anni e morì il 14 febbraio 2003 a causa di una malattia polmonare progressiva causata da un retrovirus. Si dice che sia una malattia comune nelle pecore tenute in casa e Dolly veniva raramente portata fuori a pascolare per motivi di sicurezza.

Ci sono alcune idee sbagliate sulla clonazione. Pertanto, la clonazione di una persona o di un animale non è assolutamente in grado di replicare la coscienza. L'individuo clonato non sarà dotato dell'intelligenza dell'organismo originale; avrà bisogno di educazione, educazione, ecc. Inoltre, anche la questione dell'identità esterna completa del clone è controversa. Di norma, un clone non è una copia completa dell'originale, perché Nella clonazione viene copiato solo il genotipo, il che non significa una ripetizione univoca del fenotipo dell’organismo. Il fenotipo si forma sulla base di alcuni dati genetici, tuttavia, le condizioni in cui verrà coltivato il clone possono in qualche modo influenzarne lo sviluppo: altezza, peso, fisico e alcune caratteristiche dello sviluppo mentale.

Nella maggior parte dei paesi del mondo, qualsiasi lavoro sulla clonazione riproduttiva umana è vietato. Tale clonazione umana deve affrontare problemi etici, religiosi e legali ancora più grandi rispetto alla clonazione terapeutica. In linea di principio, non esiste un’opinione pubblica definita su questo argomento, così come le più grandi religioni del mondo non sono in grado di dare una valutazione univoca di questo fenomeno, perché va oltre la portata dei loro insegnamenti classici e richiede quindi un’argomentazione. Sorgono anche alcune difficoltà legali, come questioni di paternità, maternità, eredità, matrimonio e altre ancora. Lo sviluppo della clonazione è pericoloso anche per ragioni di controllo su di essa, nonché per la possibile diffusione della tecnologia negli ambienti criminali e terroristici. Particolarmente preoccupante è l'elevata percentuale di fallimenti nella clonazione, che comporta il pericolo della comparsa di persone deformi.

4.1 Stato della ricerca sulla clonazione terapeutica in Russia.

Nonostante il boom del grande potenziale degli ESC nel trattamento di varie malattie, in Russia il lavoro sulla clonazione terapeutica non viene ancora praticamente portato avanti. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di un quadro legislativo per condurre ricerche utilizzando ovociti ed embrioni umani. Con l’adozione di tali leggi, la Russia avrà la reale opportunità di sviluppare molto rapidamente la clonazione terapeutica. Il nostro Paese dispone di tecnologie cellulari efficaci per ottenere embrioni ricostruiti mediante trapianto nucleare. In sostanza, le basi delle moderne tecnologie per il trasferimento nucleare di cellule somatiche, che combinano microchirurgia ed elettrofusione, furono sviluppate per la prima volta qui negli anni '80 del secolo scorso. Esistono anche tecnologie efficaci per ottenere linee ESC umane.

È possibile realizzare i compiti della clonazione terapeutica sulla base dei centri di riproduzione che, oltre al loro scopo diretto, possono diventare centri per l'ottenimento di linee ESC, innanzitutto direttamente per le pazienti di questo centro e per eventuali membri del loro famiglie. Si può prevedere che con lo sviluppo delle tecnologie terapeutiche, l’ottenimento delle proprie cellule staminali embrionali diventerà alla portata di tutti. È necessario realizzare una stretta collaborazione tra i centri di riproduzione e i laboratori di ricerca competenti focalizzati sulla risoluzione di problemi fondamentali e sullo sviluppo di nuove tecnologie. Tecnologie simili includono la ricostruzione di embrioni utilizzando tecniche di micromanipolazione ottico-laser non invasive a scopo di clonazione terapeutica

5. Problemi di ingegneria genetica.

L’ingegneria genetica è una tecnologia completamente nuova che abbatte le barriere genetiche fondamentali non solo tra le specie, ma anche tra le persone, gli animali e le piante. Combinando geni di specie diverse e non imparentate, cambiando per sempre i loro codici genetici, vengono creati nuovi organismi che trasmetteranno i cambiamenti genetici ai loro discendenti. Oggi gli scienziati sono in grado di tagliare, incollare, ricombinare, trasformare, modificare e programmare materiale genetico. Geni animali e perfino umani vengono aggiunti a piante o animali, dando origine a forme di vita transgeniche inimmaginabili. Per la prima volta nella storia, gli esseri umani sono diventati gli architetti della vita. I bioingegneri saranno in grado di creare decine di migliaia di nuovi organismi nei prossimi anni. Le prospettive sono spaventose. L'ingegneria genetica solleva problemi etici e di salute senza precedenti le questioni sociali, e minaccia anche il benessere dell’ambiente, la salute umana e animale e il futuro dell’agricoltura. Quanto segue descrive solo alcuni dei problemi associati all'ingegneria genetica:

Gli organismi geneticamente modificati che fuggono o vengono rilasciati da un laboratorio possono causare la distruzione dell'ambiente. Gli "inquinanti biologici" geneticamente modificati hanno il potenziale per essere più distruttivi persino degli inquinanti chimici. Poiché sono viventi, gli alimenti geneticamente modificati sono intrinsecamente più imprevedibili di quelli chimici: possono riprodursi, migrare e mutare. Una volta rilasciati nell’ambiente questi organismi geneticamente modificati, sarà quasi impossibile restituirli al laboratorio. Molti scienziati avvertono che il rilascio di tali organismi in ambiente esterno può portare a conseguenze distruttive irreversibili per l’ambiente.

È probabile che i cambiamenti genetici portino a risultati inaspettati e pericolose sorprese. La biotecnologia è una scienza imprecisa e gli scienziati non potranno mai garantire il 100% del successo. Nella pratica si sono verificati casi gravi. I ricercatori che hanno condotto esperimenti presso la Michigan State University hanno recentemente scoperto che l’alterazione genetica delle piante resistenti ai virus può far sì che i virus mutino in forme nuove e più pericolose o in forme che possono attaccare altre specie di piante. Altri scenari spaventosi: i geni estranei provenienti da piante geneticamente modificate possono essere trasferiti insieme a polline, insetti, vento o pioggia ad altre colture, così come a piante selvatiche ed erbacce. Possono verificarsi catastrofi se le proprietà delle colture geneticamente modificate, come la resistenza ai virus o agli insetti, vengono acquisite, ad esempio, dalle erbe infestanti. Le piante geneticamente modificate possono produrre tossine e altre sostanze che possono danneggiare gli uccelli e altri animali. L'ingegneria genetica di piante e animali quasi certamente metterà in pericolo le specie e le ridurrà diversità biologica. A causa dei loro geni “superiori”, alcuni degli IG di piante e animali andranno inevitabilmente fuori controllo, conquistando specie selvatiche. Ciò è già accaduto quando nel paese sono state importate specie esotiche; ad esempio, in Nord America si sono verificati problemi con la malattia dell'olmo olandese e la pueraria rampicante. Cosa accadrà alle specie selvatiche, ad esempio, quando gli scienziati rilasceranno nell’ambiente carpe, salmoni o trote che sono due volte più grandi e mangeranno il doppio del cibo dei loro parenti selvatici? Un altro pericolo risiede nella creazione di nuovi tipi di colture e di animali domestici. Una volta che gli scienziati avranno creato quello che viene chiamato il “pomodoro perfetto” o il “pollo perfetto”, questi verranno riprodotti in grandi quantità; le specie “meno desiderabili” verranno lasciate nel dimenticatoio. Animali e piante “perfetti” verrebbero quindi clonati (riprodotti come copie genetiche esatte), riducendo ulteriormente la base di geni disponibili sul pianeta.

I cambiamenti genetici nelle colture e negli animali possono innescare lo sviluppo di sostanze tossiche e reazioni allergiche nelle persone. Una persona con un’allergia alle noci o ai crostacei, ad esempio, non avrebbe modo di sapere se un pomodoro o un altro alimento è stato alterato per includere le proteine ​​dell’alimento allergenico, e il consumo di questi alimenti IG potrebbe avere conseguenze fatali. In alternativa, gli ingegneri genetici potrebbero prendere proteine ​​dai batteri presenti nel suolo, nell’oceano – ovunque – e aggiungerle al cibo umano. Tali sostanze non sono mai state aggiunte agli alimenti prima, quindi non esistono informazioni sulla loro tossicità e allergenicità.

Sono noti casi in cui gli alimenti geneticamente modificati hanno causato danni alle persone. Nel 1989 e nel 1990, l'L-triptofano geneticamente modificato, un comune integratore alimentare, ha ucciso più di 30 americani e reso permanentemente disabili più di 5.000 a causa della sindrome eosinofilia-mialgia, una malattia del sangue potenzialmente fatale e dolorosa, prima di essere vietato. Il produttore, Showa Denko K.K., la terza azienda chimica più grande del Giappone, ha utilizzato un batterio geneticamente modificato per creare questo integratore da banco. Si ritiene che il batterio sia stato in qualche modo infettato attraverso il processo di ricombinazione del DNA. I prodotti non indicano che sono stati geneticamente modificati. La brevettazione dei prodotti IG e la produzione diffusa di prodotti biotecnologici distruggeranno l'agricoltura così come è stata conosciuta fin dall'antichità. Se questa tendenza non verrà fermata, la brevettazione di piante e animali transgenici da parte dell’industria della carne e dei latticini porterà presto allo sviluppo dell’agricoltura in leasing, dove gli agricoltori prenderanno in affitto piante e animali dai conglomerati biotecnologici e pagheranno i semi e la prole. Alla fine, nei prossimi decenni, l’agricoltura sarà spazzata via e sostituita da fabbriche di biosintesi industriale controllate da aziende chimiche e biotecnologiche. Le persone non godranno mai più del cibo naturale e fresco. Centinaia di milioni di agricoltori e altri lavoratori in tutto il mondo perderanno i loro guadagni. Il sistema agricolo sostenibile sarà distrutto.

La modificazione genetica e la brevettazione degli animali ridurranno lo status degli esseri viventi a prodotti industriali e porteranno a maggiori sofferenze. Nel gennaio 1994 fu annunciato che la mappa completa del genoma di mucche e maiali era stata chiarita, cosa che precedette l'ulteriore sviluppo degli esperimenti sugli animali. Oltre alla crudeltà intrinseca di tali esperimenti (esemplari difettosi nascevano con difetti dolorosi, zoppi, ciechi, ecc.), queste creature "di produzione" non avevano maggior valore per i loro “creatori” rispetto alle invenzioni meccaniche. Gli animali geneticamente modificati per essere utilizzati nei laboratori, come il famigerato “topo di Harvard”, che aveva un gene umano che causa il cancro trasmesso a tutte le generazioni successive, sono stati progettati per soffrire. Scienza puramente riduzionista, la biotecnologia riduce il significato della vita a frammenti di informazione (codice genetico) che possono essere smontati e rimontati a piacimento. Spogliati della loro unicità e intimità, gli animali che sono meri oggetti per i loro “inventori” saranno trattati come tali. I brevetti per più di 200 animali "bizzarri" geneticamente modificati sono attualmente in attesa di approvazione.

Gli organismi geneticamente modificati non sono mai stati adeguatamente o adeguatamente testati per la sicurezza. Ad oggi, non esiste un’organizzazione governativa adeguata creata per affrontare questa nuova classe di creature radicali, che potenzialmente rappresentano enormi minacce per la salute e l’ambiente. La politica della Food and Drug Administration statunitense sugli alimenti geneticamente modificati illustra il problema. Nel maggio 1992, questo paese ha sviluppato una nuova politica riguardo ai prodotti biotecnologici: i prodotti geneticamente modificati non saranno considerati separatamente da quelli naturali; non saranno testati per la sicurezza; non conterranno un'etichetta indicante che sono stati geneticamente modificati; Il governo degli Stati Uniti non terrà traccia degli alimenti IG. Di conseguenza, né il governo né i consumatori sapranno quali alimenti integrali o trasformati sono stati geneticamente modificati. I vegetariani e le persone che escludono determinati alimenti dalla loro dieta a causa di credenze religiose si trovano di fronte alla prospettiva di consumare involontariamente frutta e verdura contenenti materiale genetico animale e persino umano. E le conseguenze sulla salute saranno determinate solo attraverso tentativi ed errori, da parte dei consumatori.

Brevettando i geni e gli organismi viventi scoperti, una piccola élite aziendale controllerà presto l'intero patrimonio genetico del pianeta. Gli scienziati che “scoprono” i geni e i modi per manipolarli possono ricevere brevetti – e quindi la proprietà – non solo delle tecnologie di modificazione genetica, ma anche dei geni stessi. Aziende chimiche, farmaceutiche e biotecnologiche come DuPont, Upjohn, Bayer, Dow, Monsanto, Cib-Geigy e Rhone-Poulenc stanno cercando urgentemente di identificare e brevettare i geni di piante, animali e persone per prendere il completo controllo dell’agricoltura e dell’allevamento e industrie manifatturiere prodotti alimentari. Sono le stesse aziende che un tempo promettevano una vita spensierata con pesticidi e plastica. Ci si può fidare dei loro progetti per il futuro?

Lo studio del genoma umano potrebbe portare alla declassificazione delle informazioni personali e a nuovi livelli di discriminazione. Ad alcune persone viene già negato assicurazione sanitaria basato su geni “cattivi”. I datori di lavoro richiederanno la scansione genetica e rifiuteranno il lavoro ai propri dipendenti in base ai risultati? Il governo avrà accesso ai nostri profili genetici personali? È facile da immaginare nuovo livello discriminazione nei confronti di coloro i cui profili genetici indicano che sono, ad esempio, meno intelligenti o predisposti a determinate malattie.

L’ingegneria genetica è già stata utilizzata per “migliorare” la razza umana, una pratica chiamata eugenetica. La scansione genetica ci permette già di scoprire se il feto porta i geni di alcune malattie ereditarie. Cominceremo presto a eliminare i feti sulla base di difetti non mortali come la miopia, l'omosessualità o per ragioni puramente estetiche? I ricercatori dell'Università della Pennsylvania hanno richiesto un brevetto per gli spermatozoi animali gastrointestinali in modo che le proprietà trasmesse da una generazione a quella successiva possano essere alterate; questo suggerisce che lo stesso è possibile con gli esseri umani. Il passaggio dall’eugenetica animale all’eugenetica umana è solo un piccolo passo. Tutti vogliono il meglio per i propri figli, ma dove ci fermiamo? Inavvertitamente, potremmo presto ripetere gli sforzi dei nazisti per creare una razza “perfetta”.

L’esercito americano sta creando un arsenale di armi biologiche geneticamente modificate. Sebbene la creazione di armi biologiche offensive sia stata resa illegale ai sensi trattati internazionali Gli Stati Uniti continuano a sviluppare tali armi per scopi di difesa. Tuttavia, gli agenti biologici geneticamente modificati sono identici sia che vengano utilizzati per la difesa o per l'attacco. Le aree di ricerca per tali armi includono quanto segue: batteri resistenti a tutti gli antibiotici; batteri e virus più resistenti e pericolosi che vivono più a lungo e uccidono più velocemente, nonché nuovi organismi che possono invalidare l’effetto di un vaccino o ridurre la resistenza naturale delle persone e delle piante. È stata esplorata anche la possibilità di sviluppare agenti patogeni in grado di sconvolgere l’equilibrio ormonale di una persona al punto da causare la morte e trasformare batteri innocui (come quelli che si trovano nell’intestino umano) in killer. Alcuni esperti ritengono che si stiano sviluppando anche agenti patogeni gastrointestinali destinati a specifici gruppi razziali.

Non tutti gli scienziati sono ottimisti riguardo all’ingegneria genetica. Tra gli scettici c'è Irwin Chargoff, un illustre biochimico spesso definito il padre della biologia molecolare. Egli avverte che non tutta l’innovazione si traduce in “progresso”. Chargoff una volta definì l'ingegneria genetica un “Auschwitz molecolare” e avvertì che la tecnologia dell'ingegneria genetica espone il mondo a rischi maggiori rispetto all'avvento della tecnologia nucleare. "Sento che la scienza ha oltrepassato una barriera che dovrebbe rimanere intatta", ha scritto nella sua autobiografia. Notando la "terrificante irreversibilità" degli esperimenti di ingegneria genetica pianificati, Chargoff avvertì che "...non è possibile annullare nuova uniforme la vita... sopravviverà a te, ai tuoi figli e ai figli dei tuoi figli. Un attacco irreversibile alla biosfera è qualcosa di così inaudito, così inimmaginabile per le generazioni precedenti, che posso solo desiderare di non esserne responsabile”.

5. conclusione

Opinione pubblica. Nonostante gli evidenti benefici della ricerca e della sperimentazione genetica, il concetto stesso di “ingegneria genetica” ha dato origine a vari sospetti e paure, ed è diventato oggetto di preoccupazione e persino controversia politica. Molti temono, ad esempio, che un virus che provoca il cancro negli esseri umani venga introdotto in un batterio che normalmente vive nel corpo o sulla pelle di una persona, e quindi questo batterio provochi il cancro. È anche possibile che un plasmide che trasporta un gene di resistenza ai farmaci venga introdotto in un pneumococco, rendendolo resistente agli antibiotici e rendendo la polmonite incurabile. Questi tipi di pericoli esistono senza dubbio. La ricerca genetica è condotta da scienziati seri e responsabili e i metodi per ridurre al minimo la possibilità di diffusione accidentale di microbi potenzialmente pericolosi vengono costantemente migliorati. Nel valutare i possibili pericoli che questi studi comportano, essi dovrebbero essere confrontati con le vere tragedie causate dalla malnutrizione e dalle malattie che uccidono e mutilano le persone.

L'ingegneria genetica è una delle tecnologie più promettenti e in via di sviluppo del nostro tempo, che in futuro sarà in grado di risolvere molti problemi in medicina e altro ancora. La mia opinione personale sulle questioni più controverse dell’ingegneria genetica tende a consentire la ricerca e l’applicazione di queste tecnologie.

A mio avviso, la modificazione genetica degli organismi, con un ragionevole controllo su questo processo, può risolverne alcuni problemi seri modernità. In particolare, l'uso della modificazione genetica in medicina per il trattamento di varie malattie mi sembra un fenomeno positivo che non solleva alcuna lamentela in questa fase dello sviluppo della scienza.

Per quanto riguarda l'uso della modificazione genetica in agricoltura e la distribuzione di prodotti geneticamente modificati, a mio avviso, la loro ipotetica pericolosità per la salute umana non è effettivamente confermata. Mi sembra che se gli studi standard sulla sicurezza di questi prodotti indicano che il loro utilizzo è possibile, non necessitano di ulteriori ricerche. Gli OGM in questo caso dovrebbero essere considerati come un nuovo tipo di pianta o prodotto e, a condizione che soddisfi tutti gli standard standard di sicurezza alimentare, il suo utilizzo dovrebbe essere chiaramente consentito. Condivido anche il punto di vista secondo cui gli GMF, grazie al controllo speciale su di essi, al miglioramento delle loro proprietà a livello genetico e all'assenza della necessità di utilizzare vari fertilizzanti dannosi per l'uomo durante la coltivazione, possono essere ancora più sicuri di prodotti normali Agricoltura.

Le questioni relative alla clonazione presentano gravi questioni etiche quando si tratta di clonazione umana. In questa fase, a mio avviso, le argomentazioni sulla necessità della clonazione riproduttiva delle persone non sono sufficientemente convincenti, e quindi il divieto della clonazione riproduttiva mi sembra giustificato. Tuttavia, ciò non significa che tutta la ricerca in questo settore debba essere interrotta, perché se la scienza può fornire una maggiore probabilità di sopravvivenza dei cloni e il pubblico può risolvere altre questioni controverse, la clonazione riproduttiva potrebbe essere consentita.

Anche la questione della clonazione terapeutica è piuttosto complicata, perché per ottenere cellule staminali è necessario fermare lo sviluppo di un embrione che, in linea di principio, può trasformarsi in un bambino. Mi sembra che questo problema etico sia in qualche modo simile al problema dell’aborto. Tuttavia, tutto considerato, sono propenso a sostenere l’autorizzazione della clonazione terapeutica perché questo può salvare la vita di una persona a costo di una possibile vita interrotta alla nascita.

Per quanto riguarda lo studio e la ricerca sui problemi della clonazione stessa, in particolare sulle questioni relative alla clonazione riproduttiva degli animali, a mio avviso dovrebbero essere consentiti, poiché non è ragionevole vietarlo nel contesto dell'uso di animali in qualsiasi altro tipo di ricerca di laboratorio.

Bibliografia.

1. Concetti di Bochkarev A. I. scienza naturale moderna: libro di testo per studenti universitari / A. I. Bochkarev, T. S. Bochkareva, S. V. Saksonov; a cura di prof. A. I. Bochkareva. – Togliatti: TGUS, 2008. – 386 pag.

2. G96Guseikhanov M.K., Radzhabov O.R. Concetti di scienze naturali moderne: libro di testo. - 6a edizione, rivista. e aggiuntivi - M .: Società editrice e commerciale "Dashkov and Co", 2007. - 540 p.

- Questa è la produzione di prodotti e materiali necessari per l'uomo utilizzando organismi viventi, cellule in coltura e processi biologici.

Opportunità delle biotecnologie sono insolitamente grandi perché i suoi metodi sono più redditizi di quelli convenzionali: vengono utilizzati per condizioni ottimali(temperatura e pressione), più produttivi, rispettosi dell'ambiente e non richiedono reagenti chimici che avvelenano l'ambiente, ecc.

Oggetti della biotecnologia: numerosi rappresentanti di gruppi di organismi viventi - microrganismi (virus, batteri, protisti, lieviti, ecc.), piante, animali, nonché cellule e strutture subcellulari da essi isolate (organelli). Basato sulla biotecnologia sui processi fisiologici e biochimici che si verificano nei sistemi viventi, a seguito dei quali viene rilasciata energia, la sintesi e la scomposizione dei prodotti metabolici e la formazione di componenti chimici e strutturali della cellula.

Principali direzioni della biotecnologia:

1) produzione con l'aiuto di microrganismi e cellule eucariotiche in coltura di composti biologicamente attivi (enzimi, vitamine, farmaci ormonali), farmaci (antibiotici, vaccini, sieri, anticorpi altamente specifici, ecc.), nonché proteine, aminoacidi utilizzati come additivi per mangimi;

2) applicazione metodi biologici anti inquinamento ( trattamento biologico acque reflue, inquinamento del suolo, ecc.) e per proteggere le piante da parassiti e malattie;

3) creazione di nuovi ceppi utili di microrganismi, varietà vegetali, razze animali, ecc.

Obiettivi, metodi e risultati delle biotecnologie.

L’umanità ha bisogno di imparare a modificare in modo efficace la natura ereditaria degli organismi viventi per potersi dotare di alimenti e materie prime di buona qualità e allo stesso tempo non portare il pianeta alla disastro ambientale. Pertanto non è una coincidenza compito principale gli allevatori del nostro tempo sono diventati la soluzione al problema della creazione di nuove forme di piante, animali e microrganismi che si adattano bene ai metodi di produzione industriale, possono resistere a condizioni sfavorevoli, utilizzare efficacemente l'energia solare e, soprattutto, consentire di ottenere prodotti biologicamente puri senza eccessivo inquinamento ambientale. Fondamentalmente nuovi approcci Una soluzione a questo problema fondamentale è l’uso dell’ingegneria genetica e cellulare nell’allevamento.

Ingegneria genetica (genetica). -

branca della genetica molecolare associata alla creazione mirata di nuove molecole di DNA in grado di moltiplicarsi in una cellula ospite e di controllare la sintesi dei metaboliti cellulari necessari.

Essendo emersi all’intersezione tra la chimica degli acidi nucleici e la genetica microbica, Ingegneria genetica si occupa di decifrare la struttura dei geni, della loro sintesi e clonazione, inserendo geni isolati dalle cellule di organismi viventi o geni appena sintetizzati in cellule vegetali e animali al fine di modificarne specificamente le proprietà ereditarie.

Per effettuare il trasferimento genico (o transgenesi) da una specie di organismo ad un'altra, spesso di origine molto distante, è necessario eseguire diverse complesse operazioni:

isolamento di geni (singoli frammenti di DNA) dalle cellule batteri, piante o animali. In alcuni casi questa operazione viene sostituita dalla sintesi artificiale dei geni necessari;

connessione (cucitura) singoli frammenti di DNA di qualsiasi origine in una singola molecola come parte di un plasmide;

introduzione del DNA plasmidico ibrido contenere il gene desiderato nelle cellule ospiti;

copiare (clonare) di questo gene nel nuovo ospite per garantirne il funzionamento.

I geni clonati vengono microiniettati nelle uova dei mammiferi o nei protoplasti vegetali (cellule isolate prive di parete cellulare) e da essi vengono coltivati ​​interi animali o piante, nel cui genoma vengono incorporati (integrati) i geni clonati. Vengono chiamate piante e animali i cui genomi sono stati alterati attraverso operazioni di ingegneria genetica piante transgeniche O animali transgenici.

Sono già stati ottenuti topi, conigli, maiali, pecore transgenici, nel cui genoma operano geni estranei di varia origine, inclusi geni di batteri, lieviti, mammiferi, esseri umani, nonché piante transgeniche con geni di altre specie non correlate. Organismi transgenici indicano il grande potenziale dell'ingegneria genetica come branca applicata della genetica molecolare (ad esempio, è stata ottenuta una nuova generazione di piante transgeniche, caratterizzate da tratti preziosi come la resistenza agli erbicidi, agli insetti, ecc.).

Oggi, i metodi dell’ingegneria genetica lo hanno reso possibile effettuare la sintesi in quantità industriali di ormoni come l'insulina, l'interferone e la somatotropina (ormone della crescita), necessari per il trattamento di una serie di malattie genetiche umane - diabete mellito, alcuni tipi di tumori maligni, nanismo,

Utilizzando metodi genetici sono stati ottenuti anche ceppi di microrganismi (Ashbya gossypii, Pseudomonas denitrificans, ecc.) che producono decine di migliaia di volte più vitamine (C, B 3, B 13, ecc.) rispetto alle forme originali.

Ingegneria cellulare-

un insieme di metodi utilizzati per costruire nuove cellule. Comprende la coltivazione e la clonazione di cellule in terreni appositamente selezionati, l'ibridazione cellulare, il trapianto di nuclei cellulari e altre operazioni microchirurgiche per il "smontaggio" e il "assemblaggio" (ricostruzione) di cellule vitali da singoli frammenti.

Al centro ingegneria cellulare sta nell'uso dei metodi coltivazione cellule e tessuti isolati su un mezzo nutritivo artificiale in condizioni controllate. Ciò è diventato possibile grazie alla capacità delle cellule vegetali, come risultato della rigenerazione, di formare un'intera pianta da una singola cellula. Sono state sviluppate condizioni di rigenerazione per molte piante coltivate: patate, grano, orzo, mais, pomodori, ecc. Lavorare con questi oggetti consente di utilizzare metodi non tradizionali di ingegneria cellulare nell'allevamento: ibridazione somatica, aploidia, selezione cellulare, superamento intransigenza nella cultura, ecc.

Clonazione -

un metodo per produrre diversi organismi identici attraverso la riproduzione asessuata (inclusa quella vegetativa). In questo modo molte specie di piante e animali si riproducono in natura da milioni di anni. Tuttavia, ora il termine "clonazione" è solitamente usato in un senso più stretto e significa copiare cellule, geni, anticorpi e persino organismi multicellulari in laboratorio. Gli esemplari che appaiono come risultato della riproduzione asessuata sono, per definizione, geneticamente identici, tuttavia in essi si può osservare una variabilità ereditaria, causata da mutazioni casuali o creata artificialmente con metodi di laboratorio.

Incarichi tematici

A1. La produzione di farmaci, ormoni e altre sostanze biologiche viene effettuata in questa direzione

1) ingegneria genetica

2) produzione biotecnologica

3) industria agricola

4) agronomia

A2. Quando è più utile la coltura dei tessuti?

1) quando si ottiene un ibrido di mela e pera

2) quando si allevano linee pure di piselli a semi lisci

3) se necessario, trapiantare la pelle su una persona con ustioni

4) quando si ottengono forme poliploidi di cavolo e ravanello

A3. Per produrre artificialmente l'insulina umana utilizzando metodi di ingegneria genetica su scala industriale, è necessario

1) introdurre il gene responsabile della sintesi dell'insulina nei batteri, che inizieranno a sintetizzare l'insulina umana

2) introdurre l'insulina batterica nel corpo umano

3) sintetizzare artificialmente l'insulina in un laboratorio biochimico

4) coltivare una coltura di cellule pancreatiche umane responsabili della sintesi dell'insulina.

La biotecnologia è la produzione consapevole di prodotti e materiali necessari agli esseri umani utilizzando organismi viventi e processi biologici.

Da tempo immemorabile, la biotecnologia è stata utilizzata principalmente nell'industria alimentare e leggera: nella vinificazione, nella panificazione, nella fermentazione dei latticini, nella lavorazione del lino e del cuoio, basata sull'utilizzo di microrganismi. Negli ultimi decenni le possibilità della biotecnologia si sono ampliate enormemente. Ciò è dovuto al fatto che i suoi metodi sono più redditizi di quelli convenzionali per il semplice motivo che negli organismi viventi le reazioni biochimiche catalizzate da enzimi avvengono in condizioni ottimali (temperatura e pressione), sono più produttive, rispettose dell'ambiente e non richiedono sostanze chimiche. reagenti che avvelenano l'ambiente.

Gli oggetti della biotecnologia sono numerosi rappresentanti di gruppi di organismi viventi: microrganismi (virus, batteri, protozoi, lieviti), piante, animali, nonché cellule isolate da essi e componenti subcellulari (organelli) e persino enzimi. La biotecnologia si basa su processi fisiologici e biochimici che si verificano nei sistemi viventi, che determinano il rilascio di energia, la sintesi e la scomposizione dei prodotti metabolici e la formazione di componenti chimici e strutturali della cellula.

La direzione principale della biotecnologia è la produzione, utilizzando microrganismi e cellule eucariotiche in coltura, di composti biologicamente attivi (enzimi, vitamine, ormoni), farmaci (antibiotici, vaccini, sieri, anticorpi altamente specifici, ecc.), nonché composti preziosi ( additivi per mangimi, ad esempio aminoacidi essenziali, proteine ​​dei mangimi, ecc.). I metodi di ingegneria genetica hanno permesso di sintetizzare in quantità industriali ormoni come l'insulina e la somatotropina (ormone della crescita), necessari per il trattamento delle malattie genetiche umane.

Uno dei settori più importanti della moderna biotecnologia è anche l'uso di metodi biologici per combattere l'inquinamento ambientale (trattamento biologico delle acque reflue, suolo contaminato, ecc.).

Pertanto, per estrarre metalli dalle acque reflue, possono essere ampiamente utilizzati ceppi batterici in grado di accumulare uranio, rame e cobalto. Altri batteri dei generi Rhodococcus e Nocardia vengono utilizzati con successo per l'emulsificazione e l'assorbimento di idrocarburi del petrolio dall'ambiente acquatico. Sono in grado di separare le fasi acquosa e oleosa, concentrare l'olio, purificare acque reflue dalle impurità del petrolio. Assimilando gli idrocarburi del petrolio, tali microrganismi li convertono in proteine, vitamine del gruppo B e caroteni.

Alcuni ceppi di alobatteri vengono utilizzati con successo per rimuovere l'olio combustibile dalle spiagge sabbiose. Sono stati ottenuti anche ceppi geneticamente modificati in grado di scomporre ottano, canfora, naftalene e xilene e utilizzare efficacemente il petrolio greggio.

L'uso di metodi biotecnologici per proteggere le piante da parassiti e malattie è di grande importanza.

La biotecnologia si sta facendo strada nell’industria pesante, dove i microrganismi vengono utilizzati per estrarre, trasformare ed elaborare le risorse naturali. Già nell'antichità i primi metallurgisti ricavavano il ferro dai minerali palustri prodotti dai batteri del ferro, che sono in grado di concentrare il ferro. Ora sono stati sviluppati metodi per la concentrazione batterica di numerosi altri metalli minerali: manganese, zinco, rame, cromo, ecc. Questi metodi vengono utilizzati per sviluppare discariche di vecchie miniere e depositi poveri, dove i metodi di estrazione tradizionale non sono economicamente sostenibili.

L'ingegneria genetica è uno dei metodi più importanti della biotecnologia. Si tratta della creazione artificiale mirata di determinate combinazioni di materiale genetico in grado di funzionare normalmente in una cellula, cioè di moltiplicarsi e controllare la sintesi dei prodotti finali. Esistono diversi tipi di metodi di ingegneria genetica, a seconda del livello e delle caratteristiche del suo utilizzo.

L'ingegneria genetica viene utilizzata principalmente sui procarioti e sui microrganismi, anche se recentemente ha iniziato ad essere utilizzata sugli eucarioti superiori (ad esempio le piante). Questo metodo prevede l'isolamento di singoli geni dalle cellule o la sintesi di geni all'esterno delle cellule (ad esempio, sulla base dell'RNA messaggero sintetizzato da un dato gene), il riarrangiamento diretto, la copiatura e la propagazione di geni isolati o sintetizzati (clonazione genica), nonché come il loro trasferimento e inclusione nel soggetto per modificare il genoma. In questo modo è possibile ottenere l’inclusione di geni “estranei” nelle cellule batteriche e la sintesi di composti importanti per l’uomo da parte dei batteri. Grazie a ciò è stato possibile introdurre il gene per la sintesi dell'insulina dal genoma umano nel genoma dell'E. coli. L’insulina sintetizzata dai batteri viene utilizzata per trattare i pazienti con diabete.

Lo sviluppo dell'ingegneria genetica è diventato possibile grazie alla scoperta di due enzimi: gli enzimi di restrizione, che tagliano la molecola del DNA in aree strettamente definite, e le ligasi, che uniscono insieme i pezzi varie molecole DNA tra loro. Inoltre, l’ingegneria genetica si basa sulla scoperta di vettori, ovvero brevi molecole circolari di DNA che si riproducono in modo indipendente nelle cellule batteriche. Con l'aiuto di enzimi di restrizione e ligasi, il gene richiesto viene inserito nei vettori e successivamente viene incluso nel genoma della cellula ospite.

L'ingegneria cellulare è un metodo per costruire un nuovo tipo di cellule basato sulla loro coltivazione, ibridazione e ricostruzione. Si basa sull'uso di metodi di coltura cellulare e tissutale. Esistono due aree dell'ingegneria cellulare: 1) l'uso di cellule trasferite in coltura per la sintesi di vari composti utili per l'uomo; 2) l'utilizzo di cellule in coltura per ottenere da esse piante rigenerate.

Le cellule vegetali in coltura sono un'importante fonte di valore sostanze naturali, poiché conservano la capacità di sintetizzare le loro sostanze caratteristiche: alcaloidi, oli essenziali, resine, composti biologicamente attivi. Pertanto, le cellule di ginseng trasferite nella coltura continuano a sintetizzare, come nella composizione dell'intera pianta, preziose materie prime medicinali. Inoltre, in coltura, qualsiasi manipolazione può essere effettuata con le cellule e i loro genomi. Utilizzando la mutagenesi indotta, è possibile aumentare la produttività dei ceppi cellulari in coltura ed effettuare la loro ibridazione (inclusa l'ibridazione a distanza) in modo molto più semplice e semplice che a livello dell'intero organismo. Inoltre, con essi è possibile svolgere lavori di ingegneria genetica, come con le cellule procariotiche.

Ibridando i linfociti (cellule che sintetizzano anticorpi, ma crescono con riluttanza e per breve tempo in coltura) con cellule tumorali che hanno un potenziale di immortalità e sono capaci di crescita illimitata in un ambiente artificiale, è stato risolto uno dei problemi più importanti della biotecnologia. palcoscenico moderno- sono state ottenute cellule di ibridoma capaci di sintesi infinita di anticorpi altamente specifici di un certo tipo.

Pertanto, l'ingegneria cellulare consente di costruire un nuovo tipo di cellule utilizzando il processo di mutazione, ibridazione e, inoltre, di combinare singoli frammenti di cellule diverse (nuclei, mitocondri, plastidi, citoplasma, cromosomi, ecc.), Cellule di vario tipo , legato non solo a diversi generi, famiglie, ma anche a regni. Ciò facilita la soluzione di molti problemi teorici e ha un significato pratico.

L’ingegneria cellulare è ampiamente utilizzata nella selezione delle piante. Sono stati sviluppati ibridi di pomodoro e patata, mela e ciliegia. Le piante con eredità alterata rigenerate da tali cellule consentono di sintetizzare nuove forme e varietà che hanno proprietà benefiche e resistente alle condizioni ambientali avverse e alle malattie. Questo metodo è ampiamente utilizzato anche per “salvare” varietà pregiate colpite da malattie virali. Dai germogli in coltura si isolano diverse cellule apicali, non ancora colpite dal virus, e da esse si rigenerano piante sane, prima in provetta, quindi trapiantate nel terreno e propagate.



Ingegneria cellulare

Ingegneria cellulare– cellule in crescita all’esterno del corpo su speciali terreni nutritivi, dove crescono e si moltiplicano, formando una coltura di tessuti. Questo è un metodo per costruire un nuovo tipo di cellule basato sulla loro coltivazione, ibridazione e ricostruzione. Ricostruzione cellulare associato alla creazione di una cellula vitale da singoli frammenti di cellule diverse (nucleo, citoplasma, cromosomi, ecc.). Con l’aiuto dell’ingegneria cellulare è possibile collegare i genomi di specie molto distanti. Viene mostrata la possibilità fondamentale di fusione delle cellule somatiche animali con cellule vegetali. Lo studio delle cellule ibride consente di risolvere molti problemi teorici di biologia e medicina: chiarire le reciproche influenze del nucleo e del citoplasma; meccanismi di differenziazione cellulare e regolazione della riproduzione cellulare, trasformazione di cellule normali in cellule tumorali, ecc.

A ibridazione combinare artificialmente cellule intere (protoplasti cellulari) per formarle genoma ibrido. Utilizzando enzimi o ultrasuoni, le pareti cellulari delle cellule vegetali vengono rimosse e i protoplasti “nudi” delle cellule vengono collegati. Successivamente, le pareti cellulari vengono ripristinate e formate callo- una massa cellulare non organizzata, che provoca la differenziazione delle cellule da cui si ottiene un'intera pianta ibrida.

L'ingegneria cellulare è ampiamente utilizzata nella biotecnologia, ad esempio nell'uso ibridi(cellule ibride) per produrre anticorpi monoclonali. Sulla base di cellule geneticamente modificate è possibile creare nuove forme di piante dotate di caratteristiche utili e resistenti alle condizioni ambientali favorevoli e alle malattie.

Ingegneria genetica - riarrangiamento artificiale del genoma. Una branca della genetica molecolare associata alla creazione mirata in vito (in vitro) di nuove combinazioni di materiale genetico in grado di moltiplicarsi in una cellula ospite e sintetizzare prodotti metabolici. Accompagnato dal trasferimento artificiale dei geni necessari da un tipo di organismo vivente (batteri, piante, animali) a un altro, spesso di origine distante. Le moderne tecnologie genetiche vengono utilizzate per la terapia genica, ad es. trattamento delle malattie ereditarie introducendo geni "sani" in una persona.

Il risultato più alto della moderna biotecnologia è la trasformazione genetica, il trasferimento di geni estranei e altri portatori materiali di ereditarietà nelle cellule di piante, animali e microrganismi, la produzione di organismi transgenici con proprietà e caratteristiche nuove o migliorate. In termini di obiettivi e capacità future, questa direzione è strategica. Permette di risolvere problemi fondamentali nella selezione di oggetti biologici per stabilità, alta produttività e qualità del prodotto, migliorando al contempo la situazione ambientale in tutti i tipi di produzione. Tuttavia, per raggiungere questi obiettivi, devono essere superate enormi difficoltà nell’aumentare l’efficienza della trasformazione genetica e, soprattutto, nell’identificare i geni, creare le loro banche di clonazione, decifrare i meccanismi di determinazione poligenica dei tratti e delle proprietà degli oggetti biologici, garantire un’elevata genetica espressione e creazione di sistemi vettoriali affidabili. Già oggi, in molti laboratori in tutto il mondo, inclusa la Russia, utilizzando metodi di ingegneria genetica, sono state create piante, animali e microrganismi transgenici fondamentalmente nuovi che hanno ricevuto riconoscimento commerciale.

Biotecnologie moderne

Biotecnologie moderne si interfaccia strettamente con numerose discipline scientifiche, svolgendone l'applicazione pratica o costituendone lo strumento principale (Fig. 1).

Riso. 1. Rapporto della biotecnologia con le altre scienze (secondo V.I. Kefeli, 1989)

Nella biologia molecolare, l'uso di metodi biotecnologici consente di determinare la struttura del genoma, comprendere il meccanismo dell'espressione genica, modellare le membrane cellulari per studiarne le funzioni, ecc. La costruzione dei geni necessari utilizzando metodi di ingegneria genetica e cellulare consente di controllare l'eredità e l'attività vitale di animali, piante e microrganismi e di creare organismi con nuove proprietà utili per l'uomo che non erano state precedentemente osservate in natura.

L’industria microbiologica attualmente utilizza migliaia di ceppi di microrganismi diversi. Nella maggior parte dei casi, vengono migliorati mediante mutagenesi indotta e successiva selezione. Ciò consente la sintesi su larga scala di varie sostanze.

Alcune proteine ​​e metaboliti secondari possono essere prodotti solo mediante coltura di cellule eucariotiche. Le cellule vegetali possono servire come fonte di numerosi composti: atropina, nicotina, alcaloidi, saponine, ecc. Anche le cellule animali e umane producono numerosi composti biologicamente attivi. Ad esempio, le cellule dell'ipofisi contengono lipotropina, uno stimolatore della disgregazione dei grassi, e somatotropina, un ormone che regola la crescita.

Sono state create colture continue di cellule animali che producono anticorpi monoclonali, ampiamente utilizzati per la diagnosi di malattie. In biochimica, microbiologia e citologia, i metodi di immobilizzazione sia degli enzimi che delle cellule intere di microrganismi, piante e animali sono di indubbio interesse. In medicina veterinaria sono ampiamente utilizzati metodi biotecnologici come la coltura di cellule ed embrioni, l'ovogenesi in vitro e l'inseminazione artificiale. Tutto ciò indica che la biotecnologia diventerà una fonte non solo di nuovi prodotti alimentari e medicinali, ma anche di energia e di nuove sostanze chimiche, nonché di organismi con le proprietà desiderate.