Materiale genetico dei batteri. Microbiologia: dispense (K

Questo libro è destinato agli studenti degli istituti di istruzione medica. Questa breve guida ti aiuterà a prepararti e a superare l'esame di microbiologia. Il materiale è presentato in una forma molto comoda e memorabile e aiuterà gli studenti a padroneggiare in dettaglio i concetti e i concetti di base del corso in breve tempo, nonché a concretizzare e sistematizzare le conoscenze.

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Il frammento introduttivo del libro Microbiologia: dispense (K. V. Tkachenko) fornito dal nostro partner per i libri - l'azienda litri.

LEZIONE N. 4. Genetica dei microrganismi. Batteriofagi

1. Organizzazione del materiale ereditario di batteri

L'apparato ereditario dei batteri è rappresentato da un cromosoma, che è una molecola di DNA, è a spirale e piegato in un anello. Questo anello è attaccato alla membrana citoplasmatica in un punto. I singoli geni si trovano sul cromosoma batterico.

Le unità funzionali del genoma batterico, oltre ai geni cromosomici, sono:

1) sequenze IS;

2) trasposoni;

3) plasmidi.

Le sequenze IS sono brevi frammenti di DNA. Non trasportano geni strutturali (codificanti proteine), ma contengono solo geni responsabili della trasposizione (la capacità di spostarsi lungo il cromosoma e di integrarsi nelle sue varie sezioni).

I trasposoni sono molecole di DNA più grandi. Oltre ai geni responsabili della trasposizione, contengono anche un gene strutturale. I trasposoni sono in grado di muoversi lungo un cromosoma. La loro posizione influenza l'espressione genica. I trasposoni possono esistere al di fuori del cromosoma (in modo autonomo), ma non sono in grado di replicarsi autonomamente.

I plasmidi sono materiale genetico extracromosomico aggiuntivo. Si tratta di una molecola di DNA circolare a doppio filamento, i cui geni codificano proprietà aggiuntive, conferendo vantaggi selettivi alle cellule. I plasmidi sono capaci di replicazione autonoma, cioè indipendentemente dal cromosoma o sotto il suo debole controllo. A causa della replicazione autonoma, i plasmidi possono dar luogo al fenomeno dell'amplificazione: lo stesso plasmide può essere presente in più copie, favorendo così la manifestazione di un determinato tratto.

A seconda delle proprietà dei tratti codificati dai plasmidi, si distinguono:

1) R-plasmidi. Fornire resistenza ai farmaci; può contenere geni responsabili della sintesi di enzimi che distruggono i farmaci, può modificare la permeabilità della membrana;

2) F-plasmidi. Codificano il sesso nei batteri. Le cellule maschili (F+) contengono il plasmide F, le cellule femminili (F-) no. Le cellule maschili agiscono come donatori di materiale genetico durante la coniugazione e le cellule femminili agiscono come riceventi. Hanno una carica elettrica superficiale diversa e quindi si attraggono. Lo stesso plasmide F passa dal donatore se si trova in uno stato autonomo nella cellula.

I plasmidi F sono in grado di integrarsi nel cromosoma cellulare e di uscire dallo stato integrato in uno autonomo. In questo caso vengono catturati i geni cromosomici che la cellula può donare durante la coniugazione;

3) Plasmidi del col. Codifica la sintesi delle batteriocine. Si tratta di sostanze battericide che agiscono su batteri strettamente imparentati;

4) Plasmidi tossici. Codifica la produzione di esotossine;

5) plasmidi di biodegradazione. Codificano gli enzimi con cui i batteri possono utilizzare gli xenobiotici.

La perdita di un plasmide da parte di una cellula non porta alla sua morte. La stessa cellula può contenere plasmidi diversi.

2. Variabilità nei batteri

Esistono due tipi di variabilità: fenotipica e genotipica.

La variabilità fenotipica - le modifiche - non influenzano il genotipo. Le modifiche interessano la maggior parte degli individui di una popolazione. Non vengono ereditati e svaniscono nel tempo, cioè ritornano al fenotipo originale.

La variazione genotipica influenza il genotipo. Si basa su mutazioni e ricombinazioni.

Le mutazioni sono un cambiamento nel genotipo che persiste per un certo numero di generazioni ed è accompagnato da un cambiamento nel fenotipo. Una caratteristica delle mutazioni nei batteri è la relativa facilità di rilevamento.

Le mutazioni si distinguono per localizzazione:

1) gene (punto);

2) cromosomico;

3) plasmide.

Per origine, le mutazioni possono essere:

1) spontaneo (mutageno sconosciuto);

2) indotto (mutageno sconosciuto).

La ricombinazione è lo scambio di materiale genetico tra due individui con la comparsa di individui ricombinanti con un genotipo alterato.

I batteri hanno diversi meccanismi di ricombinazione:

1) coniugazione;

2) fusione dei protoplasti;

3) trasformazione;

4) trasduzione.

La coniugazione è lo scambio di informazioni genetiche attraverso il contatto diretto tra donatore e ricevente. I plasmidi hanno la frequenza di trasmissione più alta e possono avere ospiti diversi. Dopo la formazione di un ponte di coniugazione tra il donatore e il ricevente, un filamento del DNA del donatore entra attraverso di esso nella cellula ricevente. Più lungo è questo contatto, maggiore sarà la quantità di DNA del donatore che potrà essere trasferita al ricevente.

La fusione dei protoplasti è un meccanismo per lo scambio di informazioni genetiche durante il contatto diretto di sezioni della membrana citoplasmatica nei batteri privi di parete cellulare.

La trasformazione è il trasferimento di informazioni genetiche sotto forma di frammenti di DNA isolati quando la cellula ricevente si trova in un ambiente contenente DNA del donatore. La trasduzione richiede uno stato fisiologico speciale della cellula ricevente: la competenza. Questa condizione è inerente alla divisione attiva delle cellule in cui avvengono i processi di replicazione dei propri acidi nucleici. In tali cellule opera un fattore di competenza: questa è una proteina che provoca un aumento della permeabilità della parete cellulare e della membrana citoplasmatica, quindi un frammento di DNA può penetrare in tale cellula.

La trasduzione è il trasferimento di informazioni genetiche tra cellule batteriche utilizzando fagi trasduttori temperati. I fagi trasduttori possono trasferire uno o più geni.

La trasduzione avviene:

1) specifico (viene trasferito sempre lo stesso gene, il fago trasduttore si trova sempre nello stesso posto);

2) non specifico (vengono trasmessi geni diversi, la localizzazione del fago trasduttore non è costante).

3. Batteriofagi

I virioni fagici sono costituiti da una testa contenente l'acido nucleico virale e da una coda.

Il nucleocapside della testa del fago ha un tipo di simmetria cubica e il processo ha un tipo elicoidale, cioè i batteriofagi hanno un tipo di simmetria mista.

I fagi possono esistere in due forme:

1) intracellulare (questo è un profago, DNA puro);

2) extracellulare (questo è un virione).

I fagi, come altri virus, hanno proprietà antigeniche e contengono antigeni specifici del gruppo e del tipo.

Esistono due tipi di interazione fago-cellula:

1) litica (infezione virale produttiva). Questo è un tipo di interazione in cui la riproduzione del virus avviene in una cellula batterica. Lei muore nel processo. Innanzitutto, i fagi vengono adsorbiti sulla parete cellulare. Poi arriva la fase di penetrazione. Il lisozima agisce nel sito di adsorbimento dei fagi e, grazie alle proteine ​​contrattili della parte della coda, l'acido nucleico dei fagi viene iniettato nella cellula. Questo è seguito da un periodo intermedio, durante il quale la sintesi dei componenti cellulari viene soppressa e si verifica la modalità disgiuntiva della riproduzione dei fagi. In questo caso, l'acido nucleico dei fagi viene sintetizzato nella regione del nucleoide, quindi la sintesi proteica avviene sui ribosomi. I fagi che hanno un tipo di interazione litica sono chiamati virulenti.

Nel periodo finale, come risultato dell'autoassemblaggio, le proteine ​​si ripiegano attorno all'acido nucleico e si formano nuove particelle fagiche. Lasciano la cellula, rompendone la parete cellulare, cioè avviene la lisi del batterio;

2) lisogenico. Questi sono fagi temperati. Quando un acido nucleico penetra in una cellula, viene integrato nel genoma della cellula e si osserva una convivenza a lungo termine del fago con la cellula senza la sua morte. Quando le condizioni esterne cambiano, il fago può abbandonare la sua forma integrata e sviluppare un'infezione virale produttiva.

In base alla specificità si distinguono:

1) fagi polivalenti (colture di lisi di una famiglia o genere di batteri);

2) monovalente (lisare le colture di un solo tipo di batteri);

3) tipico (capace di provocare la lisi solo di alcuni tipi (varianti) di una coltura batterica all'interno di una specie batterica).

I fagi possono essere utilizzati come farmaci diagnostici per determinare il genere e la specie di batteri isolati durante la ricerca batteriologica. Tuttavia, sono più spesso utilizzati per il trattamento e la prevenzione di alcune malattie infettive.

La biologia e la genetica moderne devono i loro eccezionali risultati alla microbiologia, che ha fornito loro i microrganismi come soggetti sperimentali. L'importanza e la rilevanza della ricerca nel campo della genetica dei microrganismi risiede principalmente nel fatto che sono stati i primi a creare metodi per controllare l'ereditarietà.

Nel 1865, lo scienziato ceco Gregor Mendel scoprì l'esistenza dei geni come unità discrete di ereditarietà. Nel 1928 F. Griffiths fu il primo a trasformare i pneumococchi non virulenti in virulenti. Infettò topi bianchi con una miscela di batteri composta da pneumococchi capsulari uccisi dal calore, che perdevano quindi la loro virulenza, e pneumococchi vivi acapsulari non virulenti. Negli esperimenti di controllo, questi gruppi di batteri, introdotti separatamente, non hanno ucciso i topi. Tuttavia, nel gruppo sperimentale, i topi morirono e dal loro sangue furono isolati pneumococchi vivi, che avevano acquisito la capsula dei pneumococchi uccisi. Di conseguenza, i pneumococchi capsulari uccisi contenevano una sostanza capace di trasmettere il segno della formazione delle capsule (virulenza) ai pneumococchi vivi. Il meccanismo della trasformazione è rimasto sconosciuto.

Nel 1953, F. Crick e D. Watson determinarono la struttura genetica basata sulla doppia elica del DNA. Questa scoperta ha mostrato come il gene svolge le sue tre funzioni più importanti:

• 1) continuità dell'ereditarietà - meccanismo semi-conservativo della replicazione del DNA;
• 2) controllo delle strutture e delle funzioni del corpo - utilizzando un codice genetico che utilizza una riserva di sole quattro basi (lettere) - adenina (A), timina (T), guanina (G), citosina (C);
• 3) l'evoluzione degli organismi dovuta a mutazioni e ricombinazioni genetiche.

Attraverso i lavori di F. Crick, S. Brenner, M. Nirenberg, S. Ochoa, X. Korana, utilizzando oggetti microbici, nel 1966 fu decifrato il codice genetico, furono mostrate la sua triplicità, non sovrapposizione e universalità per tutti gli organismi viventi .

Gli scienziati hanno apprezzato la facilità di lavorare con batteri e virus grazie alle loro proprietà: breve periodo di generazione, rapido accumulo di popolazioni con un numero enorme di individui, facilità di coltivazione e utilizzo. Negli oggetti batterici sono stati scoperti gli RNA messaggero, ribosomiale e di trasferimento ed è stato stabilito il meccanismo della sintesi proteica. D. Lederberg ed E. Tatum hanno scoperto la coniugazione nei batteri, V. Hayes ha scoperto un plasmide che determina la polarità sessuale dei batteri. F. Jacob ed E. Wolman crearono la teoria dei plasmidi. Il concetto di operone, sviluppato sul modello dell'Escherichia coli da F. Jacob e J. Monod, è diventato un concetto universale per il controllo genetico dell'espressione genica.

Nel 1972 è nata l'ingegneria genetica che si sta rapidamente sviluppando. Di fondamentale importanza per la sua comparsa e il controllo dell'ereditarietà fu la scoperta nel 1970 da parte di G. Temin, S. Mizutani, D. Baltimore dell'enzima trascrittasi inversa (revertasi, DNA polimerasi RNA-dipendente) in alcuni virus oncogeni. Ciò ha permesso di ottenere una copia del gene del DNA su una matrice di RNA messaggero e di utilizzarlo nell'ingegneria genetica. La biotecnologia basata sull'ingegneria genetica utilizza ampiamente enzimi batterici, vettori plasmidici e virali, nonché batteri come principali produttori di prodotti biologici.

I procarioti (batteri) hanno strutture cellulari morfologicamente distinte contenenti informazioni genetiche: i nucleoidi. Il nucleoide è costituito da un cromosoma a spirale, che si trova liberamente nel citoplasma, ma è associato a determinati recettori sulla membrana citoplasmatica. Pertanto, una cellula batterica, a differenza degli eucarioti, è aploide, cioè contiene un set di geni.

In alcune condizioni, le cellule batteriche possono contenere copie di un cromosoma completamente identiche nel loro insieme di geni e i batteri rimangono aploidi. A differenza di tutti gli altri organismi, i batteri hanno la proprietà unica di modificare la massa del loro DNA, regolando il contenuto delle copie dei loro geni a seconda delle condizioni di vita, equivalenti alla massa di 2, 4, 6, 8 cromosomi. Ciò consente loro di regolare il ritmo della propria riproduzione, una delle condizioni principali che garantiscono la sopravvivenza dei batteri nell'ambiente e quindi la conservazione delle specie in natura.

Il cromosoma batterico è una molecola di DNA a doppio filamento (cromosoma circolare) contenente geni disposti in ordine lineare. Poiché la lunghezza del cromosoma (y Escherichia coli circa 1000 µm) è molte volte più lunga della lunghezza di un batterio (1,5-3,0 µm in media), il cromosoma è compatto in una forma superavvolta sotto forma di 12-80 anse associate ad una struttura centrale rappresentata da una classe speciale di RNA - 4,5 S RNA. Il genoma (l'intero insieme di nucleotidi contenuti nel cromosoma di un dato individuo) e il genotipo (l'intero insieme di singoli geni in un dato individuo) nei batteri non sono univoci, ma sono vicini, poiché la maggior parte dei geni sono contenuti nel cromosoma in il singolare, a differenza degli eucarioti che contengono fino al 30-50% di sequenze nucleotidiche ripetute nel genoma. Pertanto, la dimensione dei genomi nei batteri, nei virus e nei plasmidi è espressa in peso molecolare, o nel numero di coppie nucleotidiche dell'acido nucleico genomico, o nel numero di geni. Questi valori sono comparabili, poiché in media ogni gene è costituito da 1000 coppie di nucleotidi e la massa di un nucleotide del DNA è di 500 dalton. Sì, cromosoma Escherichia coli ha un peso molecolare di 2,8 x 10 9 dalton, il numero di coppie di nucleotidi è 3,8 x 10 6 e contiene 2500-3000 geni.

Il cromosoma batterico è costituito da due tipi di geni: strutturali (cistron), che codificano la sintesi di una specifica catena polipeptidica, e regolatori (o accettori), che regolano l'attività dei geni (regolatori, operatori, promotori, attenuatori, terminatori, ecc.) . La principale unità strutturale e funzionale di un cromosoma è l'operone. Si tratta di un gruppo di geni strutturali del cistrone fisicamente legati tra loro e al gene operatore che ne controlla l'espressione. A sua volta, un operone o un gruppo di essi è sotto il controllo di un gene-regolatore, che rappresenta un'unità strutturale e funzionale più complessa: un regulon.

I geni sono disposti linearmente su un cromosoma, quindi è possibile studiarne la sequenza e compilare una mappa cromosomica (genetica). Per fare ciò, viene studiato il tempo di trasferimento dei geni corrispondenti durante la coniugazione batterica. La localizzazione dei geni sul cromosoma è determinata in minuti dal loro trasferimento, in particolare per l'Escherichia coli - da 0 a 100 minuti.

Attualmente, il metodo principale per studiare l'organizzazione dei genomi degli organismi viventi è il sequenziamento, determinando la sequenza dei nucleotidi nel DNA dei geni. Innanzitutto, utilizzando la tecnica della clonazione, si ottiene un gran numero di frammenti di DNA necessari. La sequenza nucleotidica dei cromosomi del DNA dei 20 batteri più importanti è già stata completamente studiata (K il parassita è E. coli, P. aeruginosa e così via.).

Alcuni geni e gruppi di geni di cromosomi batterici e plasmidi batterici appartengono a elementi genetici trasponibili, cioè strutture genetiche in grado di spostarsi in forma intatta all'interno di un dato genoma o di spostarsi da un genoma all'altro, ad esempio da plasmide a batterico e viceversa. Gli elementi genetici trasponibili sono rappresentati da elementi IS e trasposoni. Gli elementi IS, o sequenze di inserimento, sono generalmente di piccole dimensioni e non superano le duemila paia di basi. Portano solo un gene che codifica per una trasposasi proteica, con l'aiuto della quale gli elementi IS vengono integrati in varie parti del cromosoma. Sono designati: IS 1, IS2, IS3, ecc. I trasposoni (Tp) sono segmenti più grandi di DNA fiancheggiati da elementi IS invertiti. Oltre ai geni che ne consentono la trasposizione, contengono vari altri geni. All'interno di un trasposone grande possono esserci trasposoni più piccoli.

I trasposoni sono in grado di inserirsi in diverse parti di un cromosoma o di spostarsi da un genoma all'altro. Molto spesso i trasposoni sono contenuti nei plasmidi R. I trasposoni sono stati trovati nei genomi di batteri, plasmidi, virus ed eucarioti. Svolgono un ruolo importante nella variabilità e nell'evoluzione della materia vivente. I trasposoni sono designati dal numero di serie: Tn1, Tn2, Tn3, ecc.

Tutti i plasmidi conosciuti sono piccole molecole di DNA a doppio filamento, chiuse covalentemente in un anello, superavvolte, le cui dimensioni variano da 1,5 a 200 MD (da 1500 a 400.000 coppie di nucleotidi). Maggiore è il peso molecolare, più complesso è l'insieme dei geni e più diverse sono le funzioni dei plasmidi. I plasmidi contengono geni di autoreplicazione; geni che controllano l'autotrasferimento o la mobilitazione per il trasferimento; altri geni che determinano le funzioni specifiche del plasmide stesso. Ad esempio, i plasmidi F determinano le funzioni donatrici della cellula e la sua capacità di coniugarsi; Plasmidi ent: sintesi di enterotossine; plasmidi biodegradabili: distruzione di vari composti organici e inorganici.

I plasmidi sono caratterizzati dalle seguenti proprietà:

• replica autoregolata;
• il fenomeno dell'esclusione superficiale (un meccanismo che non consente a un altro plasmide correlato di entrare in una cellula che già contiene un plasmide);
• il fenomeno dell'incompatibilità (due plasmidi strettamente correlati non possono coesistere stabilmente in una cellula, uno di essi viene rimosso);
• controllo del numero di copie del plasmide per cromosoma cellulare (ci sono copie basse - 1-4 copie e copie alte - da 12 a 38 copie del plasmide);
• controllo della conservazione stabile dei plasmidi nella cellula ospite;
• controllo della distribuzione uniforme dei plasmidi figli nelle cellule batteriche figlie;
• capacità di auto-trasferimento (nei plasmidi coniugativi);
• capacità di essere mobilitato per il trasferimento (in plasmidi non coniugativi);
• la capacità di fornire alla cellula ospite ulteriori importanti proprietà biologiche che promuovono la sopravvivenza di batteri e plasmidi in natura.

I plasmidi si diffondono tra i batteri in due modi: verticalmente - mediante trasferimento dalla cellula madre alle cellule figlie durante il processo di divisione cellulare batterica; orizzontalmente - mediante trasferimento tra cellule in una popolazione batterica indipendentemente dalla divisione cellulare. Il trasferimento dei plasmidi tra cellule batteriche avviene mediante il meccanismo di autotrasferimento mediante coniugazione controllata dal tra-operone del plasmide. A seconda della presenza di questo operone, i plasmidi si dividono in coniugativi e non coniugativi. Sono possibili anche altri meccanismi di trasferimento dei plasmidi (mobilizzazione per il trasferimento di plasmidi non coniugativi utilizzando plasmidi coniugativi, trasformazione, trasduzione).

La classificazione dei plasmidi si basa sulla loro proprietà unica di incompatibilità, vale a dire l'incapacità dei plasmidi correlati di coesistere stabilmente nella stessa cellula. Si manifesta dopo che il plasmide penetra in una cellula che contiene già un plasmide strettamente correlato. I plasmidi incompatibili tra loro, ma compatibili con gli altri, vengono combinati in un unico gruppo Inc. Ad esempio, negli enterobatteri sono stati trovati 39 plasmidi del gruppo Inc. I plasmidi appartenenti allo stesso gruppo Inc hanno molte caratteristiche comuni.

I plasmidi hanno un importante significato medico, poiché controllano la sintesi di vari fattori di patogenicità dei batteri e la loro resistenza ai farmaci. Il significato biologico generale dei plasmidi è che sono un mezzo unico di autodifesa dei batteri e favoriscono la conservazione dei batteri in natura.

Il trasferimento delle informazioni genetiche alla prole (replicazione vegetativa del DNA) avviene nei batteri e nei plasmidi secondo un meccanismo universale: la replicazione semi-conservativa del DNA. In questo caso, le cellule figlie ricevono il DNA cromosomico, in cui un filamento è parentale (conservatore), l'altro filamento di DNA viene nuovamente sintetizzato sulla sua matrice, il che garantisce una trasmissione molto accurata delle informazioni genetiche (ereditarietà). La replicazione vegetativa del DNA nei batteri inizia da un sito cromosomico strettamente fisso (oriC), che viene riconosciuto dagli enzimi che avviano la replicazione. È di natura semi-conservativa, va simultaneamente in due direzioni e termina in un punto strettamente fisso: il capolinea. Poiché le catene del DNA sono antiparallele (se un filamento inizia dalla 5a estremità, l'altro dalla 3a estremità) e la DNA polimerasi III effettua la sintesi del DNA solo nella direzione 5-3, la replicazione avviene in modo diverso su ciascun filamento: su uno dei i filamenti non attorcigliati (“dritto”, “leader”) procede ininterrottamente, e dall'altro (“ritardato”) la DNA polimerasi III deve ritornare per far crescere il filamento anche nella direzione 5-3, in modo intermittente, attraverso la formazione di segmenti di Okazaki con una lunghezza di circa 1000 nucleotidi nei batteri.

La velocità di replicazione del DNA in E. coli a 37 °C corrisponde all'incorporazione di 2 x 10 3 coppie di nucleotidi al secondo. La replicazione del DNA coinvolge un complesso di enzimi che formano un'unica struttura: il replisoma. Il controllo genetico della replicazione del DNA è esercitato da un ampio gruppo di geni cromosomici.

Oltre al tipo vegetativo, i batteri hanno tipi coniugativi e riparativi di replicazione del DNA. La replicazione coniugativa avviene durante il metodo coniugativo di scambio di materiale genetico ed è controllata da geni plasmidici (tra-operone). In questo caso, il secondo filamento di DNA è completato, il filamento complementare viene trasferito dal donatore al ricevente. La replicazione riparativa funge da meccanismo per eliminare il danno strutturale dal DNA o avviene nella fase finale della ricombinazione genetica. È controllato da geni cromosomici e plasmidici.

Le informazioni contenute nel genoma batterico vengono decifrate, materializzate e implementate attraverso la biosintesi delle proteine. L'universalità del codice genetico corrisponde all'universalità della sua decodificazione e attuazione (espressione). Tuttavia, la biosintesi delle proteine ​​nei batteri presenta alcune caratteristiche nella fase di trascrizione. I geni dei batteri, a differenza dei geni degli eucarioti e dei virus, non contengono nitroni, quindi i batteri non hanno un processo di splicing durante la sintesi dell'mRNA. Lo splicing dell'RNA è un processo in cui gli introni (sequenze non codificanti nei geni con una struttura introne-esone) vengono eliminati dalle trascrizioni primarie dell'RNA e gli esoni vengono uniti insieme, determinando la formazione e quindi la traduzione dell'mRNA maturo. La mancanza di splicing dell'RNA nei batteri è una barriera genetica naturale nell'implementazione dell'informazione genetica eucariotica nei batteri (procarioti). Il superamento di questa barriera ha portato alla creazione dell'ingegneria genetica su oggetti batterici.

L'informazione genetica è realizzata dai microrganismi in modo molto "economico", in conformità con le condizioni specifiche della loro esistenza. Solo i geni necessari per garantire la vitalità cellulare in determinate condizioni “lavorano” (sono espressi). L'autoregolazione del sistema di informazione genetica è assicurata dalla presenza in esso, oltre ai geni strutturali che codificano per proteine ​​e altre macromolecole, di speciali sequenze nucleotidiche (geni accettori o regolatori) che non hanno funzioni codificanti, ma controllano il funzionamento dei sistemi strutturali geni. Come già accennato, un insieme di geni strutturali e regolatori situati nelle vicinanze costituisce un operone, l'unità di regolazione genetica. Il modello classico di operone è l'operone del lattosio. Consideriamo, usando l'esempio dell'operone del lattosio di Escherichia coli, la sua struttura e il metodo di regolazione dell'attività dei geni strutturali che codificano la sintesi degli enzimi coinvolti nell'assorbimento del lattosio.

L'operone inizia con il "sito di attacco della proteina attivatrice" - il prodotto del regulone a monte (proteina Cap, senza la quale l'RNA polimerasi non può contattare l'operone e iniziare la trascrizione). Successivamente sul cromosoma c'è un promotore, un sito per il riconoscimento da parte della RNA polimerasi e il suo attaccamento. Poi arriva l'operatore, il sito a cui si lega una speciale proteina regolatrice che inibisce la trascrizione. Dopo l'operatore, i geni strutturali z, y e a si trovano in sequenza, codificando, rispettivamente, la sintesi di tre enzimi coinvolti nella digestione del lattosio: R-galattosidasi, galattoside permeasi, tiogalattoside transacetilasi. L'operone lac termina con un terminatore, una piccola sezione di DNA che funge da segnale di arresto che arresta la progressione della RNA polimerasi e la trascrizione dell'operone. Al di fuori dell'operone 1ac, in un altro punto del cromosoma, c'è uno speciale gene regolatore che codifica la sintesi continua di una proteina regolatrice. Quando non c’è lattosio nell’ambiente, la proteina regolatrice si attacca all’operone e, come una “barriera”, impedisce il movimento della RNA polimerasi dal promotore ai geni strutturali, reprimendo la trascrizione e, in definitiva, la sintesi degli enzimi. Il lattosio, se presente nel mezzo nutritivo, si lega alla proteina regolatrice e modifica allostericamente la sua configurazione, per cui la proteina regolatrice non può più attaccarsi all'operatore. Di conseguenza, la “barriera” viene aperta, la RNA polimerasi trascrive i geni strutturali nel corrispondente mRNA, sulla matrice di cui vengono sintetizzati gli enzimi che digeriscono il lattosio.

Pertanto, il lattosio induce la sintesi degli enzimi necessari per il suo assorbimento. Tali enzimi sono chiamati adattivi o induttivi. Il tipo di regolazione dell'attività genica considerata è detta negativa, poiché si basa sulla repressione dell'operone da parte di una proteina regolatrice. Esistono due varianti di questo tipo di regolazione: l’induzione negativa, che abbiamo esaminato, e la repressione negativa.

In quest'ultimo caso, nella posizione iniziale, la proteina regolatrice non può legarsi all'operatore, e avviene la sintesi enzimatica, e in presenza di un effettore, solitamente il prodotto finale dell'azione degli enzimi anabolici, la proteina regolatrice, sotto la sua influenza , si lega all'operatore e la sintesi enzimatica viene repressa. Oltre al negativo, è noto anche un tipo positivo di regolazione genetica della sintesi proteica. La sua differenza dal tipo negativo è che il prodotto proteico del gene regolatore non impedisce la trascrizione dell'operone, ma, al contrario, lo attiva. Questo tipo di regolazione si trova anche nei batteri in due varianti: induzione positiva e repressione positiva. Ad esempio, l'operone ara, che controlla l'assorbimento dell'arabinosio, funziona nell'Escherichia coli attraverso un meccanismo di induzione positiva.

La manifestazione delle caratteristiche degli organismi viventi, controllata dal genotipo, dipende dalle condizioni di esistenza dell'organismo. L'insieme delle caratteristiche di un organismo nelle condizioni specifiche della sua esistenza è chiamato fenotipo. A seconda delle condizioni, i microrganismi dello stesso genotipo possono avere fenotipi diversi, poiché vengono implementate parti diverse dell'informazione genetica del genotipo o l'implementazione avviene in un intervallo diverso della norma di reazione del genotipo. Il cambiamento dei fenotipi quando cambiano le condizioni di esistenza di un organismo è chiamato modificazione. In altre parole, le modifiche sono differenze fenotipiche causate da fattori esterni in microrganismi ereditariamente identici.

I segni distintivi della modificazione nei batteri sono (tre “O”):

• certezza della variabilità (un determinato fattore o condizioni ambientali provoca un cambiamento in una caratteristica strettamente definita);
• comunità di cambiamenti (cambiamenti in un tratto simultaneamente in tutti o nella maggior parte degli individui di una popolazione geneticamente omogenea);
• reversibilità dei cambiamenti (i cambiamenti non vengono ereditati, dopo la cessazione del fattore esterno scompaiono).

In alcuni casi, nei batteri si osservano le cosiddette modifiche a lungo termine, quando un cambiamento in un tratto persiste per diverse generazioni dopo la cessazione dell'azione del fattore. Ciò è dovuto al fatto che durante la divisione cellulare vengono trasferite non solo le strutture del genotipo, ma anche il contenuto della cellula, che trattiene parzialmente i resti di sostanze formate in condizioni precedenti.

Consideriamo un esempio di variabilità della modificazione dei batteri. Quando si semina una coltura batterica diluita Proteus vulgaris Nell’arco di 24 ore sull’agar nutriente sono cresciute colonie di batteri, ciascuna delle quali è circondata da una zona di sciamatura. Dopo aver riseminato le colonie su agar nutriente con bile, tutte le colonie sono cresciute entro 24 ore senza sciamare. Dopo aver riseminato queste colonie sull'agar nutriente originale, tutte le colonie coltivate presentavano nuovamente zone di sciamatura.

I cambiamenti nel fenotipo di Proteus su terreno con bile devono essere considerati una modifica, poiché sono presenti tutte e tre le caratteristiche distintive: certezza della variabilità (la connessione tra l'assenza di sciamatura e il fattore - bile), variabilità generale (cambiamenti in tutte le colonie della popolazione), reversibilità (in assenza di bile nel mezzo nutritivo, riportano i batteri al fenotipo originale).

La possibilità di modificazione batterica dovrebbe essere costantemente presa in considerazione nel lavoro pratico dei microbiologi. Per una tassonomia e un'identificazione accurate dei batteri, è necessario osservare rigorosamente le condizioni standard (unificate) per lo studio delle proprietà dei batteri (mezzi nutritivi standard, test, reagenti, temperatura e altre condizioni di coltivazione).

La fonte primaria di nuovi geni in natura sono le mutazioni. Non esiste una definizione generalmente accettata di mutazione. Mutazione dal lat. la mutatio è un cambiamento nelle strutture genetiche presenti nella cellula in un dato momento, che viene ereditato stabilmente. Esistono due gruppi di mutazioni: aberrazioni cromosomiche, di cui 3 tipi (cambiamenti nel numero di serie di cromosomi, cambiamenti nel numero di cromosomi individuali, riarrangiamenti cromosomici) e mutazioni genetiche. I batteri possono presentare mutazioni come riarrangiamenti cromosomici e mutazioni genetiche. In questo caso, i riarrangiamenti cromosomici avvengono attraverso divisioni (perdita di un frammento cromosomico), inversione (rotazione di una sezione cromosomica di 180°), trasposizioni (inserimento di piccoli frammenti di DNA in qualche punto dei cromosomi, ad esempio segmenti di inserzione o trasposoni). Le mutazioni genetiche possono essere a sito singolo (in una regione del gene) o multisito. Perché si manifesti una mutazione in un gene, è sufficiente un singolo punto di cambiamento in una coppia di nucleotidi. La direzione della mutazione può essere diretta o inversa. Le mutazioni dirette causano cambiamenti nelle caratteristiche di un organismo di tipo selvatico; le mutazioni posteriori sono accompagnate dal ritorno al tipo selvatico. Il ripristino del fenotipo originale come risultato di una mutazione inversa in un'altra parte del gene o in un altro gene è una mutazione soppressore. Una mutazione che modifica due o più caratteristiche di un organismo è detta pleiotropica. Esistono anche mutazioni spontanee e indotte. Le mutazioni spontanee avvengono spontaneamente, nel senso che sono determinate, ma non ne conosciamo le cause specifiche. Le mutazioni indotte sono causate dall'esposizione a determinati fattori mutageni. Questi includono vari tipi di radiazioni ionizzanti, raggi ultravioletti e mutageni chimici.

La variabilità nel meccanismo di mutazione è caratterizzata da alcune caratteristiche distintive.

• 1. Ereditarietà.
• 2. Bassa frequenza (tasso) di mutazione (nei batteri 1 x 10 6 - 1 x 10 7, cioè mutazione in una cellula su 1-10 milioni). La capacità di produrre mutazioni (mutabilità) è influenzata dal genotipo. Nei batteri, la mutabilità aumenta notevolmente se hanno geni speciali: mutatori. Ad esempio, nell'Escherichia coli sono stati trovati due geni mutatori: mut T, mut SI.
• 3. Non direzionalità della variabilità (cioè incertezza, inadeguatezza dei cambiamenti nelle caratteristiche a causa di un fattore influenzante; lo stesso fattore provoca mutazioni diverse).

Gli esperimenti di S. Luria e M. Delbrück (test di fluttuazione), Newcomb (test di ridistribuzione) hanno dimostrato l'esistenza nelle popolazioni originarie di batteri di mutanti spontanei resistenti al fattore d'influenza - il fago - ancor prima della sua influenza. La tecnica dell'impronta digitale (replica) sviluppata da D. Lederberg ha permesso di isolare direttamente i mutanti da una popolazione di cellule prima dell'esposizione a un fattore adeguato o dopo l'esposizione a un mutageno - una varietà di mutanti che non hanno caratteristiche adeguate.

I batteri hanno sistemi speciali per riparare i danni mutazionali del DNA. I sistemi più studiati sono: “fotoriattivazione”, “riparazione oscura”, “riparazione replicativa”. La “fotoriattivazione” ripara i difetti (dimeri di timina) nel DNA causati solo dai raggi ultravioletti. Durante la “riparazione oscura”, un complesso di enzimi opera per ripristinare il danno su un filamento di DNA tagliando l’area danneggiata e sintetizzando al suo posto un secondo filamento di segmento di DNA complementare che sostituisce il difetto. Il sistema di “riparazione replicativa” sostituisce il danno a entrambi i filamenti del DNA attraverso la ricombinazione.

Un altro meccanismo di variabilità ereditaria è lo scambio di materiale genetico tra cellule di popolazioni batteriche (orizzontalmente). Non crea nuovi tratti elementari, ma accelera notevolmente la creazione di organismi con nuove combinazioni di tratti grazie alla ridistribuzione di geni da genomi diversi, che contribuisce al rapido adattamento dei batteri alle condizioni ambientali. I batteri sono capaci di estesi scambi genetici tra specie e generi diversi, nonché con batteriofagi e plasmidi. Nei batteri sono state identificate tre forme principali di scambio di materiale genetico: trasformazione, trasduzione, coniugazione (Fig. 3.2, 3.3). Differiscono nel modo in cui viene trasmesso il materiale genetico.

La trasformazione è caratterizzata dal trasferimento di alcuni geni del donatore alla cellula ricevente utilizzando DNA libero isolato dal genoma del donatore. La trasformazione può essere spontanea o indotta. La trasformazione spontanea in condizioni naturali si manifesta nella comparsa di ricombinanti quando si mescolano cellule geneticamente diverse. Si verifica a causa del DNA rilasciato dalle cellule nell'ambiente durante la loro lisi o come risultato del rilascio attivo di DNA da parte di cellule donatrici vitali. La trasformazione indotta (artificiale) avviene quando il DNA purificato ottenuto dai batteri donatori viene aggiunto alla coltura batterica. Una trasformazione riuscita richiede una serie di condizioni legate al DNA e ai batteri riceventi. Il DNA deve essere a doppio filamento, avere frammenti di 3-5 x 10 6 dalton ed essere parzialmente o completamente omologo al DNA del ricevente. Le cellule riceventi devono avere competenza, cioè la suscettibilità, che si verifica solo durante un certo periodo del ciclo di vita, è dovuta al rilascio da parte della cellula di uno speciale “fattore di competenza” proteico e ad un cambiamento specifico nella permeabilità della parete cellulare e della membrana. Il processo di trasformazione consiste in diverse fasi: legame del DNA sulla superficie di un batterio ricevente competente al “fattore di competenza”, penetrazione del DNA mediante “trazione” nella cellula, inclusione del DNA nel cromosoma del batterio ricevente mediante ricombinazione, espressione di geni trasferiti. L'efficienza della trasformazione genetica aumenta molte volte se la miscela di DNA e cellule trasformate viene trattata con un impulso elettrico (metodo di elettrotrasformazione). In condizioni naturali, l’efficienza della trasformazione è meno significativa rispetto ad altre forme di trasferimento di materiale genetico. Le cellule batteriche hanno un meccanismo per proteggere il genoma dal DNA estraneo: speciali sistemi di modifica e restrizione. Questi sistemi proteggono il loro DNA modificandolo (solitamente mediante metilazione) e distruggono il DNA estraneo utilizzando enzimi speciali: le endonucleasi di restrizione. Una particolare opzione di trasformazione è la trasfezione, quando il DNA batteriofago o plasmidico viene introdotto in una cellula ricevente priva di parete cellulare.

La trasduzione è il trasferimento di materiale genetico da una cellula donatrice a una cellula ricevente mediante batteriofagi. Esistono trasduzioni generali (non specifiche) e specifiche. Il meccanismo di trasduzione generale è che durante la riproduzione intracellulare di un fago virulento, al posto del DNA fagico, nella sua testa può essere accidentalmente incluso un frammento di DNA batterico uguale alla lunghezza del fago. Così nascono i fagi difettosi che invece del proprio DNA genomico contengono un frammento di DNA del batterio donatore. Tali fagi mantengono proprietà infettive. Vengono adsorbiti sulla cellula batterica e introducono al suo interno il DNA, ma il fago non si riproduce. Nel caso della ricombinazione genetica di un frammento di DNA del donatore introdotto da un fago con il cromosoma della cellula ricevente, il nuovo tratto viene fissato ereditariamente. Pertanto, durante la trasduzione generale, il fago è solo un portatore passivo di materiale genetico.

La trasduzione specifica si distingue per il trasferimento di un frammento di DNA rigorosamente definito di un batterio donatore da parte di batteriofagi temperati. Come è noto, i batteriofagi temperati sono quelli in grado di integrare le cellule batteriche nel cromosoma, provocandone la lisogenizzazione. Un fago temperato (profago) integrato nel cromosoma di un batterio donatore, in determinate condizioni, lascia il cromosoma, “afferrando” le sezioni di DNA più vicine del cromosoma batterico e lasciando dietro di sé parte del suo genoma. Si forma un fago temperato difettoso che incorpora i geni batterici del batterio donatore nel suo genoma. Successivamente, il fago trasduttore introduce il suo DNA nella cellula del batterio ricevente, dove, insieme ad un frammento di DNA del batterio donatore, viene integrato nel cromosoma ricevente. Successivamente, il fago può lasciare il cromosoma del ricevente, ma i geni del batterio donatore da esso trasferiti rimangono nel ricevente. Un esempio è il batteriofago temperato lambda (X), che porta sempre l'operone gal o onerone bio. La trasduzione specifica e generale è a bassa frequenza (10 -4 - 10 -7 per 1 particella fagica). Una variante particolare della trasduzione specifica è la conversione fagica o lisogenica. Il fago trasduttore, integrandosi nel cromosoma ricevente, provoca la lisogenizzazione del batterio e trasferisce i geni per nuove caratteristiche, ad esempio la formazione di tossine, ai batteri della difterite. Tuttavia, i geni che controllano il nuovo tratto sono costantemente inclusi nel genoma di tali fagi trasduttori. La comparsa di questi geni non è associata alla riproduzione preliminare del fago su donatori tossigeni. Il fago probabilmente ha incorporato questi geni nel suo genoma nelle prime fasi della sua evoluzione. Tali fagi trasduttori non sono difettosi e causano la conversione dei fagi con una frequenza molto elevata.

La coniugazione è caratterizzata dal trasferimento di materiale genetico attraverso il contatto diretto tra le cellule. Questo processo è polare: il materiale genetico viene trasferito solo dai batteri donatori ai batteri riceventi. La funzione della cellula donatrice e il processo di coniugazione sono controllati da geni di trasferimento della coniugazione (tra-operone), localizzati nei plasmidi coniugativi. Tra i tanti plasmidi coniugativi c'è il plasmide F, che controlla solo queste funzioni. In uno stato autonomo, extracromosomico, garantisce alla cellula donatrice di tipo F+ (maschio), la formazione di villi cavi (F-pili) e il suo trasferimento nelle cellule riceventi F- (femminili). In questo caso, il cromosoma del donatore non viene trasferito e i riceventi che hanno ricevuto il plasmide F acquisiscono il tipo donatore F+. Quando il plasmide F è integrato nel cromosoma del batterio ospite, si forma Hfr (alta frequenza di ricombinazione) - ceppi batterici con un'alta frequenza di trasmissione dei geni cromosomici. Tuttavia, il plasmide F di solito non passa nella cellula ricevente, poiché si trova all'estremità del cromosoma opposto a quello da cui inizia la sua transizione.

Il passaggio di un cromosoma attraverso un ponte di coniugazione tra cellule attraverso il canale F-pili è associato alla sua replicazione. In questo caso, attraverso il ponte passa solo un filamento di DNA del cromosoma, sul quale nella cellula ricevente viene sintetizzato un secondo filamento complementare e quindi, sotto il controllo dei geni di ricombinazione (geni di ricombinazione) del cromosoma ricevente, il il frammento di DNA trasferito viene integrato nel cromosoma ricevente. Il plasmide F può ritornare nei ceppi Hfr allo stato extracromosomico originale catturando una regione adiacente del cromosoma batterico. In questo modo si forma il plasmide F' (F-prim), che porta parte dei geni cromosomici del batterio ospite, ad esempio il plasmide F' lac. Il trasferimento dei geni del donatore nelle cellule riceventi tramite plasmidi F' è chiamato sessuduzione. In questo caso, il plasmide F’ trasferisce il suo genoma, che contiene anche alcuni geni donatori, con alta frequenza, ma il cromosoma del batterio donatore non viene trasferito.

Anche il trasferimento di altri tipi di plasmidi coniugativi (R, Ent, Col, ecc.) avviene con alta frequenza. Va notato che il trasferimento efficace dei plasmidi mediante coniugazione non conosce barriere “correlate” e avviene tra batteri di specie e generi diversi.

In qualsiasi forma di scambio di materiale genetico, la fase finale è la ricombinazione tra il DNA risultante e il cromosoma della cellula ricevente. Quando un filamento di DNA viene trasferito, viene prima completato con un filamento complementare. Solo il DNA a doppio filamento si ricombina tra loro. Sono note la ricombinazione generale, la ricombinazione sito-specifica e la ricombinazione controllata da elementi trasponibili.

La ricombinazione generale avviene tra DNA omologhi. La ricombinazione sito-specifica è dovuta alla presenza di siti specifici nelle molecole di DNA ricombinanti, ad esempio i cromosomi Escherichia coli e il batteriofago temperato lambda. Le ricombinazioni generali e sito-specifiche sono controllate dal gene hea A. Anche le ricombinazioni effettuate da elementi trasponibili sono sito-specifiche e determinate da speciali sequenze nucleotidiche, ma non dipendono dal gene hea A. Il ruolo principale nei processi di ricombinazione nei batteri appartiene al gene A. Il suo prodotto, la proteina Rec A (peso molecolare 38 kDa), ha funzioni uniche: si lega saldamente ai singoli filamenti di DNA; favorisce il rilascio del filamento spezzato dalla doppia elica del DNA; tiene insieme il singolo filamento del DNA e la doppia elica del DNA; ha la proprietà di un'ATPasi DNA-dipendente. Il gene A è coinvolto non solo nel processo di ricombinazione. Il suo prodotto è necessario per la riparazione post-replicativa, l'induzione del profago, la divisione cellulare e altre importanti funzioni dei batteri. Le mutazioni recessive in un tale gene influenzano tutte queste funzioni, quindi sono chiamate funzioni SOS e la loro totalità rappresenta un singolo sistema SOS. L'espressione di qualsiasi funzione SOS dipende dall'attività del prodotto del gene hec A. Il sistema SOS viene attivato dopo eventuali effetti dannosi sul DNA. Pertanto, il gene hec A è di primaria importanza nell'autodifesa del sistema genetico dei batteri.

L'uso di metodi genetici per studiare il genoma batterico ha permesso di creare una tassonomia genetica dei batteri. Sulla sua base, l'attuale classificazione dei batteri è stata notevolmente chiarita e sono stati creati i prerequisiti per lo sviluppo della tassonomia e della classificazione naturale. Nell'interesse della tassonomia, vengono utilizzati numerosi metodi. Metodo di ibridazione DNA-DNA (rilevazione del livello di omologia del DNA). Si ritiene che una misura del 60-100% di omologia del DNA indichi una parentela a livello di specie. Tuttavia non esistono criteri generalmente accettati. Il metodo di ibridazione DNA-rRNA rivela connessioni genetiche tra la regione del DNA che controlla la sintesi dell'rRNA e i nucleotidi dell'rRNA. I cistron responsabili della sintesi dell'rRNA sono conservativi e consentono di identificare le relazioni a livello di genere e famiglia. Il metodo più affidabile è il sequenziamento del DNA. Questo metodo rivela la sequenza nucleotidica in singoli frammenti di DNA o nell'intero DNA di un cromosoma. Il miglior oggetto di studio (il più conservativo) è la regione del DNA che controlla la sintesi dell'RNA ribosomiale 16S batterico. Il DNA di questo frammento viene clonato e poi sequenziato. Il metodo di sequenziamento del DNA consente di identificare la parentela dei batteri a livello di regno, classe, famiglia e genere, ma non è abbastanza sensibile per stabilire la specie. Questo metodo permette di identificare le relazioni evolutive dei batteri ed è fondamentale nella sistematica genetica. Nei batteri più importanti è stata studiata mediante sequenziamento la sequenza completa dei nucleotidi del DNA cromosomico (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, ecc.).

È stato rivelato il meccanismo genetico dell'importantissimo problema medico della resistenza ai farmaci acquisita nei batteri.

È stato stabilito che i plasmidi R che trasportano i geni per la resistenza a 1-10 antibiotici in qualsiasi combinazione sono di primaria importanza nel rapido sviluppo della resistenza batterica agli antibiotici. Possono trasferire i geni della resistenza agli antibiotici ai batteri sensibili in pochi minuti, rendendo resistente l’intera popolazione di batteri nel corpo. Non esistono ancora mezzi efficaci per rimuovere i plasmidi R o bloccarne la trasmissione. Finora il vero risultato è l’uso di farmaci che bloccano l’attività degli enzimi che distruggono gli antibiotici, controllati dai plasmidi R. Ad esempio, per inattivare la beta-lattamasi, l'acido clavulanico, il sulbactam, il tazobactam vengono utilizzati in combinazione con antibiotici del gruppo beta-lattamico.

È stato stabilito il controllo genetico dei fattori di patogenicità batterica. È stata dimostrata la possibilità di localizzare questi geni nei genomi di batteri, batteriofagi e plasmidi. Sono stati identificati i meccanismi di formazione di ceppi patogeni tra i batteri opportunisti. Queste informazioni consentono di identificare i batteri patogeni utilizzando metodi biologici molecolari e di ottenere intenzionalmente ceppi vaccinali avirulenti di microrganismi.

Un importante risultato nel campo della genetica è lo sviluppo del metodo della reazione a catena della polimerasi (PCR), che è stato insignito del Premio Nobel (Mullis K., 1993). Sulla base della PCR è stato creato un sistema universale fondamentalmente nuovo per l'indicazione dei microrganismi e la diagnosi delle malattie infettive: la genoindicazione. Il metodo PCR consente di amplificare (“moltiplicare”, clonare) alcune sezioni di DNA in vitro, ottenendo milioni di copie di questo DNA in 2-4 ore. L'essenza del metodo PCR è un processo ciclico multiplo, che comprende alternativamente tre fasi in ciascun ciclo: denaturazione termica del DNA (fusione), sua ricottura (attacco di primer oligonucleotidici sintetici), sintesi (completamento del secondo filamento di DNA con un DNA termostabile polimerasi). Il cambiamento di queste fasi avviene a seguito di una variazione della temperatura della miscela di reazione in uno speciale dispositivo amplificatore (ciclatore termico). La denaturazione delle copie originali e successive del DNA, che porta alla divisione del DNA in due singoli filamenti, avviene a 90-95°C per 40-50 secondi. La ricottura (aggiunta di primer) avviene ad una temperatura di 40-65 °C. I primer - oligonucleotidi sintetici (20-30 nucleotidi) - sono attaccati a un bersaglio di DNA a filamento singolo, fiancheggiando il frammento di DNA specifico desiderato. I primer sono selezionati in modo tale da limitare il frammento desiderato e essere complementari ai filamenti opposti del DNA; in questo caso, un primer è su un filo, l'altro è sul lato opposto. Sintesi (allungamento) - il completamento del secondo filamento del DNA Il DNA avviene a 72 °C con la partecipazione della Tag-DNA polimerasi. Il completamento del secondo filamento di DNA avviene dall'estremità da 5" a quella da 3" di ciascun filamento di DNA, cioè in direzioni opposte. Come risultato del primo ciclo si formano due copie della regione del DNA limitata dal primer. La durata del ciclo è di 2-2 minuti o 30-40 secondi, a seconda del tipo di termociclatore. Come risultato di ogni ciclo successivo, il numero di copie sintetizzate raddoppia in modo esponenziale (Fig. 3.4). Tipicamente, la PCR comprende 20-30 cicli, che garantiscono la sintesi di 1 milione di copie del frammento di DNA desiderato.

Riso. 3.4.

Per rilevare i prodotti della PCR vengono utilizzati l'elettroforesi o altri sistemi di rilevamento.

La PCR è adattata per rilevare la maggior parte dei microrganismi di importanza medica. Permette di rilevare rapidamente il microrganismo desiderato direttamente nel materiale in studio senza identificare una coltura pura, ed ha un'elevata sensibilità (1 x 10 1 - 1 x 10 3 microrganismi per 1 g di materiale). La PCR ha trovato ampia applicazione per la rilevazione di microrganismi difficili da coltivare e a crescita lenta (virus, clamidia, rickettsia, micoplasmi, spirochete, micobatteri).

LF, FIU, PF. Lezione n.6

A. Fondamenti

Organizzazione del materiale genetico nei batteri.

L'informazione ereditaria dei batteri è immagazzinata nel DNA, che in una cellula procariotica è chiuso circolarmente, a doppio filamento, superavvolto ed è rappresentato da due tipi di molecole: una grande - un nucleoide, dove sono codificati i segni vitali, e quelle piccole - fattori extracromosomici di ereditarietà (plasmidi, trasposoni, sequenze IS e batteriofagi temperati), in cui sono codificate caratteristiche aggiuntive.

Fattori extracromosomici dell'ereditarietà e loro integrazione nel nucleoide.

I plasmidi possono, come un nucleoide, autoreplicarsi e quindi appartenere a fattori ereditari autonomi (a differenza degli altri - non autonomi, che sono in grado di replicarsi solo come parte di un nucleoide o plasmide inoltre, i plasmidi, come i fagi temperati); , possono essere integrati in un nucleoide solo in aree omologhe, a differenza dei trasposoni e delle sequenze IS che possono essere integrati nel nucleoide in qualsiasi sua area.

Plasmidi.

I plasmidi svolgono due possibili funzioni in una cellula batterica: regolatrice (contenente duplicati di alcuni geni del nucleoide) e codificante (portando geni che non si trovano nel nucleoide), e possono esistere in due stati (autonomo, cioè all'esterno del nucleoide, e integrato nella cellula batterica). nucleoide ) e, a seconda del contenuto del tra-operone in essi, essere coniugativo (se questo operone è contenuto in un dato plasmide) e non coniugativo.

Funzioni dell'operone tra.

L'operone Tra determina la possibilità del processo di coniugazione (determina la formazione dei pili coniugativi e il processo di trasferimento unilaterale del materiale genetico attraverso di essi: un plasmide o una sezione di un nucleoide).

Plasmidi F.

I plasmidi F sono il tra-operone stesso, senza geni aggiuntivi, determinano il trasferimento in seguito alla coniugazione di se stessi, così come di un'altra molecola di DNA in cui è integrato il plasmide F (se questa molecola di DNA è un plasmide non coniugante, quindi come risultato dell'integrazione F -plasmide, diventa coniugazione e viene trasferito attraverso la coniugazione pil; se è una molecola di DNA - un nucleoide, durante la coniugazione viene trasferita la sua parte, ma non il F-plasmide stesso).

Formazione di diversi stati del plasmide F.

Un plasmide F da uno stato autonomo può entrare in uno stato integrato nel nucleoide (in questo caso si chiama fattore Hfr), e anche ritornare in uno stato autonomo (mantenendo completamente la sua composizione o “scambiando” la sua regione terminale con il nucleoide - in quest'ultimo caso tale plasmide ricombinante è chiamato plasmide F').

R-plasmidi.

I plasmidi R sono plasmidi che determinano la resistenza multifarmaco (o resistenza, da cui il nome) di una cellula batterica agli antibiotici; sono costituiti da geni che determinano tale resistenza (r-operone) e da un plasmide F (che in questo caso viene chiamato fattore RTF.

Composizione dell'operone r.

Questo operone contiene geni che determinano la resistenza agli antibiotici e può anche contenere un trasposone o parte di esso: una sequenza IS.

Meccanismi di resistenza batterica agli antibiotici causati dalla presenza di plasmidi R.

Il plasmide R può determinare: la capacità di una cellula batterica di inattivare un antibiotico, la capacità di una cellula batterica di modificare un antibiotico facendo perdere a quest'ultimo la sua attività antibatterica, la capacità di una cellula batterica di ridurre la permeabilità della parete cellulare ad un dato antibiotico.

Plasmidi batteriocinogeni (usando l'esempio del col-plasmide di E. coli).

I plasmidi batteriocinogeni determinano la sintesi di sostanze simili agli antibiotici – batteriocine; in E. coli, i plasmidi batteriocinogenici sono chiamati colicinogenici (come in altri batteri - con il nome della specie) o Col-plasmidi, e le batteriocine sono chiamate colicine (con lo stesso principio).

Caratteristiche delle colicine.

Le colicine sono proteine ​​che uccidono la cellula batterica ma non la lisano.

Trasposoni.

I trasposoni sono sequenze nucleotidiche che includono sequenze IS (che determinano la capacità dei trasposoni di cambiare la loro posizione in una molecola di DNA, nonché di "saltare" da una molecola di DNA a un'altra - i cosiddetti "geni che saltano"), geni che determinano qualsiasi tratto , così come speciali strutture terminali, grazie alle quali i trasposoni possono trovarsi in uno stato autonomo (poiché, grazie a queste “estremità appiccicose”, si chiudono in un anello).

Sequenze IS.

Le sequenze IS includono solo geni di trasposizione; a differenza dei trasposoni, non possono trovarsi in uno stato autonomo.

Meccanismi di conversione fagica.

Quando, in seguito alla lisogenizzazione (cioè all'integrazione nel genoma di un batteriofago delle zone temperate), un batterio acquisisce un carattere aggiuntivo, ciò può essere dovuto a tre possibili meccanismi: derepressione del gene del profago, introduzione del gene corrispondente da parte di un gene difettoso fago, attivazione di un gene “silenzioso” a causa del danno al suo stesso promotore da parte del promotore profago.

Modificazioni nei batteri.

Le modifiche sono variabilità fenotipica nei batteri.

Mutazioni nei batteri.

Con la variabilità mutazionale nei batteri, si verificano cambiamenti nella struttura primaria del DNA, che si esprimono nella perdita ereditaria o nel cambiamento di qualsiasi caratteristica (o caratteristiche); con mutazioni spontanee, i fattori che le hanno causate (mutageni) sono sconosciuti - molto spesso le mutazioni spontanee si verificano a causa di errori della DNA polimerasi durante la replicazione del DNA, si distinguono mutazioni inserzionali che si verificano a causa dell'integrazione di fattori ereditari extracromosomici nel nucleoide; le mutazioni indotte nei batteri sono causate sperimentalmente dall'azione di uno specifico mutageno.

Dissociazioni RS.

La dissociazione SR è il fenomeno in cui le forme R compaiono in una coltura pura che forma forme S di colonie; Secondo il suo meccanismo, la dissociazione SR è una mutazione inserzionale che porta alla perdita di geni che controllano la sintesi delle unità polisaccaridiche LPS nella membrana esterna della parete cellulare.

Mutageni.

Per mutageni si intendono sostanze chimiche o fattori fisici che causano cambiamenti pre-mutazionali nel DNA che, a causa di errori negli enzimi di riparazione o durante il processo di riparazione, si trasformano in mutazione.

Riparazioni nei batteri.

Questo termine si riferisce al processo di ripristino del DNA danneggiato da parte degli enzimi dei sistemi di riparazione della cellula batterica.

Variabilità della ricombinazione nei batteri.

Per variabilità della ricombinazione si intende la variabilità che si verifica a seguito dell'inclusione di un segmento di DNA di una cellula donatrice nel DNA della cellula ricevente; nei batteri, ci sono cinque tipi di ricombinazioni genetiche (cioè cinque tipi di variabilità della ricombinazione): trasformazione (trasferimento diretto di materiale genetico da una cellula donatrice a una cellula ricevente), trasduzione (trasferimento di materiale genetico da una cellula donatrice a una cellula ricevente utilizzando batteriofagi difettosi), coniugazione (trasferimento di materiale genetico dalla cellula donatrice alla cellula ricevente mediante coniugazione pili), lisogenizzazione (durante la quale materiale genetico esogeno viene introdotto nel genoma della cellula ricevente - il genoma di un fago temperato), conversione fagica (diversa dalla lisogenizzazione solo in quanto cambia il fenotipo della cellula donatrice).

Ingegneria genetica in microbiologia medica.

Nella microbiologia medica vengono sempre più utilizzati metodi di ingegneria genetica, con l'aiuto dei quali i microrganismi sono "costretti" a produrre i farmaci necessari nella pratica medica (vaccini, ormoni, interferoni, citochine, ecc.) Introducendo il gene corrispondente nel loro genoma, cioè. ottenere un ceppo ricombinante con le proprietà desiderate attraverso la variabilità della ricombinazione “diretta”.

Metodi genetici utilizzati nella diagnostica microbiologica.

Nella medicina moderna si stanno diffondendo sempre più metodi genetici di diagnostica microbiologica: la determinazione della percentuale di guanina e citosina nel genoma batterico, il metodo di ibridazione molecolare e soprattutto la reazione a catena della polimerasi (PCR).

Metodo di ibridazione molecolare.

Questo metodo viene utilizzato per identificare il grado di somiglianza di diversi DNA (quando si identificano i microrganismi, il DNA del ceppo isolato viene confrontato con il DNA del ceppo di riferimento).

Reazione a catena della polimerasi.

La PCR può essere eseguita per raggiungere tre scopi: rilevare un tipo specifico di microrganismo in materiale patologico senza isolare una coltura pura, identificare colture pure isolate di microrganismi, genotipizzare i microrganismi, ad es. determinazione delle varianti genetiche di una specie; il principio della PCR è quello di aumentare (amplificare) la quantità del gene desiderato in caso di reazione positiva o l'assenza di tale aumento in caso di reazione negativa (cioè viene estratto il DNA e, se contiene il gene desiderato , la sua quantità aumenta notevolmente durante la reazione, che viene rilevata mediante elettroforesi).

B. Corso di lezioni

B. Materiale teorico

11. Organizzazione del materiale genetico nei batteri
11.2. Plasmidi
11.3. Plasmidi F
11.4. R-plasmidi
11.6. Trasposoni
11.7. Sequenze IS
12. Modificazioni, mutazioni e riparazioni nei batteri
12.1. Modificazioni nei batteri
12.2. Mutazioni nei batteri
12.3. Dissociazione RS
12.4. Mutageni
12.5. Riparazioni
13. Ricombinazione genetica nei batteri, ingegneria genetica in microbiologia medica
13.1. Tipi di ricombinazione genetica nei batteri
13.2. Ingegneria genetica in microbiologia medica
14. Applicazione dei metodi genetici alla diagnostica microbiologica
14.1. Metodo di ibridazione molecolare
14.2. Reazione a catena della polimerasi

ORGANIZZAZIONE DEL MATERIALE GENETICO NEI BATTERI

11.1. Schema generale di organizzazione del materiale genetico di una cellula batterica

L'organizzazione del materiale genetico nei batteri si basa su un principio comune a tutte le forme sulla Terra. Pertanto, questo materiale viene presentato tenendo conto delle conoscenze degli studenti del corso di genetica generale: vengono trattate solo le caratteristiche genetiche caratteristiche di una cellula procariotica. L'informazione ereditaria dei batteri, come di tutte le forme di vita cellulare (a differenza dei virus), è immagazzinata nel DNA (Fig. 11.1-1), che in una cellula procariotica è rappresentato da due tipi di molecole.

Riso. 11.1-1. Diagramma della struttura del DNA

R. Sono codificati i segni vitali, senza i quali una cellula batterica non può esistere nucleoide(vedere sezione 4.2).

B. I segni non vitali sono codificati nei batteri durante fattori extracromosomici dell'ereditarietà: plasmidi, trasposoni, sequenze IS e batteriofagi temperati. Senza queste caratteristiche, una cellula batterica può esistere in condizioni normali, ma caratteristiche aggiuntive codificate nei fattori ereditari extracromosomici danno a un certo numero di cellule della popolazione ulteriori opportunità di sopravvivere quando le condizioni ambientali cambiano e, aumentando l’eterogeneità della popolazione, migliorano la sopravvivenza. capacità adattative di quest’ultimo. Ad esempio, il tratto di resistenza alla penicillina non è richiesto in condizioni normali e non influisce sulla vitalità di una cellula batterica, ma quando questo antibiotico compare nell'ambiente esterno, possono sopravvivere solo quei batteri che hanno un plasmide che codifica il tratto corrispondente. E solo quelle popolazioni batteriche che contengono cellule che trasportano il plasmide corrispondente possono sopravvivere in presenza di penicillina.

1. Secondo la capacità di auto-replicarsi i fattori extracromosomici dell'ereditarietà sono divisi in due gruppi: autonomi e non autonomi.

UN. Autonomo I fattori extracromosomici dell'ereditarietà nei batteri sono plasmidi. Ciò significa che sono in grado di replicarsi in modo indipendente, avendo il proprio operone corrispondente.

B. Non autonomo fattori extracromosomici di ereditarietà nei batteri sono i trasposoni, le sequenze IS e i fagi temperati. Senza avere un proprio operone che garantisca la replicazione, possono replicarsi solo in una molecola di DNA che possiede tale operone, sia in un nucleoide che in un plasmide.

2. Tutti i fattori extracromosomici dell'ereditarietà nei batteri possono essere integrati nel nucleoide (e, di conseguenza, lasciare la sua composizione). A seconda della posizione di inserimento nel nucleoide Anche i fattori extracromosomici dell'ereditarietà sono divisi in due gruppi.

UN. Soltanto nelle regioni omologhe può essere integrato nel nucleoide dei plasmidi e dei batteriofagi temperati. Ciò significa che per un particolare plasmide e per un particolare batteriofago del clima temperato c'è solo un punto nel nucleoide in cui questo particolare plasmide o questo particolare batteriofago può essere incluso nel nucleoide.

B. In qualsiasi zona può essere integrato nel nucleoide mediante trasposoni e sequenze IS.

11.2. Plasmidi

I plasmidi sono fattori autonomi extracromosomici di ereditarietà nei batteri.

R. I plasmidi, come altri fattori extracromosomici dell'eredità batterica, aumentano l'eterogeneità genetica della popolazione batterica. Questa può essere considerata la loro funzione principale, che svolgono insieme ai trasposoni, alle sequenze IS e ai batteriofagi temperati. Nello specifico, i plasmidi vengono isolati due funzioni: normativa e codificazione.

1. I plasmidi possono trasportare gli stessi geni presenti nel nucleoide. Se per qualche motivo uno di questi geni nucleoidi diventa silenzioso, si attiveranno geni plasmidici identici: il tratto desiderato sarà ancora presente nel fenotipo della cellula batterica. Questa funzione dei plasmidi è chiamata normativo.

2. Codifica la funzione dei plasmidi è che possono contenere geni assenti nel cromosoma batterico (cioè nucleoide). In realtà, questa funzione dei plasmidi coincide con la funzione generale di tutti i fattori ereditari extracromosomici: aumentare l'eterogeneità del genotipo della popolazione.

B. Come la maggior parte degli altri fattori ereditari extracromosomici, i plasmidi possono esistere in una cellula batterica in due stati.

1. Se il plasmide si trova all'esterno del nucleoide, nel citoplasma, si dice che lo sia autonomo condizione (da non confondere con il concetto di “fattore autonomo di ereditarietà”).

2. Il plasmide incluso nel nucleoide si trova in integrato condizione.

B. A seconda contenuto dell'operone tra(che sarà discusso più dettagliatamente di seguito) anche i plasmidi sono divisi in due gruppi.

1. Vengono chiamati i plasmidi contenenti l'operone tra coniugativo, perché tali plasmidi possono provocare il trasferimento di materiale genetico dalla cellula donatrice alla cellula ricevente attraverso il processo di coniugazione (vedi sezione 13.1).

UN. L'operone Tra determina la formazione pili coniugativo.

B. Inoltre, l'operone tra determina una catena di eventi chiamata mobilitazione per il trasferimento. In questo caso, una sezione di DNA a doppio filamento si srotola prima, poi uno dei suoi filamenti passa attraverso la pila coniugativa in un'altra cellula batterica ricevente, dove viene completato il secondo filamento complementare. Pertanto, durante la coniugazione, la cellula donatrice non perde materiale genetico, ma la cellula ricevente lo acquisisce (nonostante l'apparente significato della definizione di coniugazione come “il trasferimento di materiale genetico dalla cellula donatrice alla cellula ricevente mediante pili coniugativi).

1 . L'operone Tra può mobilitarsi per il trasferimento plasmide coniugativo(come avviene nel caso di trasferimento durante la coniugazione di un plasmide F+, vedi paragrafo 11.3).

2 . L'operone Tra può reclutare un altro plasmide non coniugativo per il trasferimento (come accade nel caso del trasferimento durante la coniugazione di un plasmide RTF, vedere la sezione 11.4).

3 . L'operone Tra può mobilitare una regione del nucleoide della cellula donatrice per il trasferimento (come avviene durante la coniugazione causata dal plasmide Hfr, vedere sezione 11.3).

2. I plasmidi che non portano l'operone tra sono chiamati, rispettivamente, non coniugativo, Perché non sono in grado di determinare il processo di coniugazione.

D. I plasmidi sono divisi in due gruppi e in base al grado di controllo sulla loro replicazione dal lato nucleoide.

1. Vengono trovati plasmidi di grandi dimensioni (cioè quelli con un peso molecolare relativamente grande). sotto stretto controllo dal lato nucleoide sopra la sua replicazione. Il nucleoide “consente” loro, di regola, solo una divisione “extra”. Di conseguenza, tali plasmidi si trovano in una o due copie nella cellula.

2. Vengono trovati plasmidi piccoli (cioè aventi un peso molecolare relativamente basso). sotto un controllo indebolito sul lato del nucleoide sopra la loro replicazione e possono dividersi molto più spesso di esso, pertanto in una cellula batterica possono essere presenti fino a 30 copie di tali plasmidi contemporaneamente.

D. Infine, i plasmidi vengono classificati in gruppi di incompatibilità. Il fatto è che i plasmidi correlati non possono essere presenti contemporaneamente nella stessa cellula batterica, perché se uno di essi è già presente in esso, l'altro non potrà più penetrarlo (questo fenomeno si chiama immunità alla superinfezione e riguarda anche la relazione dei virus con una cellula sensibile). Di conseguenza, i plasmidi correlati tra loro e incompatibili nella stessa cellula costituiscono un gruppo di incompatibilità. Attualmente esistono più di venti gruppi di incompatibilità di questo tipo tra i plasmidi.

11.3. Plasmidi F

I plasmidi F rappresentano l'operone tra stesso, senza geni aggiuntivi. Questo plasmide è anche chiamato fattore di genere o un fattore di fertilità (da cui il nome) perché la presenza del plasmide F trasforma la cellula in un possibile donatore di materiale ereditario durante la coniugazione (cioè in una cellula “maschio”), rispettivamente, una cellula priva del plasmide F è un potenziale destinatario di materiale genetico durante la coniugazione (cellula “femminile”). La cellula ricevente, dopo aver ricevuto il plasmide F durante la coniugazione, si trasforma così da femmina a maschio (cioè si verifica il “cambio di sesso”).

A. Il plasmide F, che si trova in uno stato integrato, si chiama Plasmidi Hfr(alta frequenza di ricombinazione – alta frequenza di ricombinazione). Se la cellula donatrice contiene il fattore Hfr durante la coniugazione, durante la coniugazione la catena nucleoide si rompe nel sito di attacco di questo fattore e l'estremità del DNA opposta alla posizione del fattore Hfr inizia a entrare nel ponte di coniugazione. Poiché il ponte di coniugazione non è stabile, il contatto tra le cellule durante la coniugazione è di breve durata e l'intera catena del DNA nucleoide semplicemente non ha il tempo di passare nella cellula ricevente. Di conseguenza, il fattore Hfr stesso non viene trasferito in questo tipo di coniugazione (non si verifica il cambio di sesso) e il frammento nucleoide viene introdotto nella cellula ricevente con un'alta frequenza (poiché la coniugazione avviene, di regola, tra cellule della stessa specie ) si ricombina con il cromosoma della cellula ricevente .

B. F-plasmide, essendo in uno stato autonomo, passa esso stesso durante la coniugazione nella cellula ricevente. In questo caso, la cellula ricevente passa da “femmina” a “maschio” (si verifica cioè un cambio di sesso), ma il materiale genetico introdotto nella cellula ricevente, rappresentato da geni plasmidici, raramente si ricombina con il cromosoma batterico, perché è legati al materiale genetico cromosomico, grado di omologia relativamente basso.

B. Il fattore di genere può passare da uno stato autonomo a uno di integrazione e da uno stato di integrazione a uno autonomo. Quest'ultimo processo può essere accompagnato da uno scambio di parti adiacenti del plasmide e del nucleotide, a seguito del quale il plasmide che è passato in uno stato autonomo verrà ricombinato - conterrà un frammento del nucleoide, lasciando il proprio frammento in esso invece. Questo plasmide è designato come F'-plasmide. Se la cellula donatrice trasporta il plasmide F' durante la coniugazione, allora passa nella cellula ricevente, producendo in quest'ultima un “cambio di sesso”, ma allo stesso tempo provocando un'alta frequenza di ricombinazione (a causa del frammento nucleoide incluso) . La formazione dei diversi stati del plasmide F sopra descritto è illustrata in Fig. 11-3-1.

11.4. R-plasmidi

I plasmidi R sono plasmidi che determinano la resistenza multifarmaco (o resistenza, da cui il nome) di una cellula batterica alle sostanze antibatteriche (principalmente antibiotici).

UN. Composizione del plasmide R determinato dalla presenza di due operoni principali. Pertanto, questo plasmide può essere in due forme.

1. Se il plasmide R contiene il tra-operone, in questo caso lo è il plasmide R coniugativo. L'operone Tra in questo plasmide è chiamato fattore RTF (fattore di trasferimento di resistenza). I geni che determinano la resistenza agli antibiotici formano il cosiddetto operone r (per essere più precisi, la resistenza a ciascun antibiotico è determinata da un operone r separato, cioè il plasmide R comprende diversi operoni r), che a sua volta , può anche esistere come plasmide indipendente. In altre parole, il plasmide coniugativo R è costituito da due plasmidi: il fattore RTF e il fattore r (che può essere inteso come l'inclusione di un plasmide r più piccolo all'interno di un plasmide RTF più grande).

2. Non coniugativo la forma di questo plasmide consiste solo nell'operone r.

B. Incluso nell'operone r può includere molti geni.

1. Innanzitutto, questi sono i geni che determinano sintesi di enzimi specifici.

UN. Questi potrebbero essere enzimi antibiotico inattivante.

B. O enzimi modificante gli antibiotici. In questo caso l'antibiotico modificato (ad esempio fosforilato) perde la sua attività antibatterica.

V. Infine, questi potrebbero essere enzimi che ridurre la permeabilità della parete cellulare a questo antibiotico, per cui non può penetrare all'interno della cellula batterica e “arrivare” al bersaglio della sua azione (ad esempio, ai ribosomi per bloccare qui la sintesi proteica).

2. In secondo luogo, l'operone r può contenere un tutto trasposone o parte di esso - È la sequenza(vedi sotto).

B. Dalla composizione dell'operone r diventa chiaro principali meccanismi di resistenza batterica agli antibiotici, causato dalla presenza di plasmidi R. Ce ne sono tre.

1. Il plasmide R può determinare la capacità di una cellula batterica inattivare l'antibiotico.

2. Oppure il plasmide R può determinare in questo modo la capacità di una cellula batterica modificare l'antibiotico che di conseguenza perderà la sua attività antibatterica.

3. Infine, il plasmide R può determinare diminuzione della permeabilità della parete cellulare a un dato antibiotico e quindi negargli l'accesso all'obiettivo della sua azione.

D. R-plasmide non è sempre trasmesso attraverso la coniugazione.

1. Nei batteri gram-positivi, il plasmide R viene spesso trasmesso trasduzione.

2. Attraverso coniugazione Il plasmide R viene spesso trasmesso nei batteri gram-negativi.

11.5. Plasmidi batteriocinogeni (usando l'esempio del plasmide Col di E. coli)

I plasmidi batteriocinogenici sono inerenti a quasi tutti i tipi di batteri. Determinano la sintesi di sostanze simili agli antibiotici: le batteriocine. Considereremo questi plasmidi usando l'Escherichia coli come esempio. I suoi plasmidi batteriocinogeni sono chiamati colicinogeni (come altri batteri - con il nome della specie) o Col-plasmidi (il più grande gruppo di plasmidi colicinogeni) e le batteriocine sono chiamate colicine (con lo stesso principio).

UN. Composizione del plasmide Col determinato dalla presenza di due operoni principali.

1. Questo plasmide contiene, in primo luogo, i geni che determinano la sintesi colicine.

UN. Le colicine lo sono scoiattoli.

B. Ce ne sono più di 25 tipi colicina.

V. Colicine non funzionano su una cellula che trasporta un plasmide colicinogenico di tipo identico.

d. Le colicine uccidono la cellula batterica, ma non lisare esso, che impedisce la comparsa di prodotti tossici del decadimento cellulare nell'habitat dei batteri sopravvissuti.

2. E in secondo luogo, il plasmide Col contiene tra operone. Di conseguenza, si riferisce ai plasmidi coniugativi.

B. Il plasmide Col differisce dagli altri plasmidi in molti modi unici caratteristiche.

1. A differenza di altri plasmidi coniugativi, il plasmide Col raramente si integra nel nucleoide. Sebbene tutti i plasmidi coniugativi siano per definizione capaci di farlo, altrimenti non sarebbero in grado di mobilitare una regione del cromosoma batterico per il trasferimento (vedi sezione 11.3.A).

2. Il plasmide Col è solitamente represso, cioè. le informazioni non vengono rimosse da esso. Quelli. il tratto che determina non è necessario alla cellula in condizioni normali.

3. Quando questa caratteristica diventa richiesta e il plasmide Col viene derepresso, la cellula batterica sintetizza le colicine e muore. In altre parole, il plasmide Col lo è potenzialmente letale.

IN. Senso I plasmidi Col possono essere visti da due prospettive.

1. Biologico Il significato del plasmide Col è che aiuta a raggiungere la rarefazione della popolazione quando manca il substrato nutritivo. Ciò avviene secondo il seguente schema (Fig. 11.5-1).

UN. La popolazione contiene cellule con diversi tipi di plasmidi Col (contrassegnati in diversi colori nella figura). Quando il mezzo nutritivo è esaurito, il plasmide Col in una delle cellule viene depresso, questa cellula sintetizza il tipo corrispondente di colicina e muore.

B. Le colicine agiscono solo su quelle cellule che non contengono il plasmide Col, che determina la sintesi delle colicine di questo particolare tipo. Di conseguenza, le cellule contenenti il ​​plasmide Col, che determina la sintesi delle colicine di questo tipo, rimangono vive.

V. Tuttavia, altre cellule della popolazione che trasportano plasmidi Col di altri tipi muoiono, la popolazione si impoverisce ("meno mangiatori") e, di conseguenza, può prolungare la sua vita in un ambiente impoverito.

2. Medico Il significato del plasmide Col-plasmid è che con il suo aiuto, E. coli, che normalmente popola l'intestino umano, regola la normale microbiocenosi - un insieme di microrganismi che popolano l'intestino di una persona sana, poiché le colicine agiscono non solo sulle cellule di della propria specie, ma anche su cellule di altre specie di batteri del gruppo intestinale.

11.6. Trasposoni

I trasposoni, come le sequenze IS, sono spesso chiamati “geni che saltano”. A causa della loro capacità, a differenza dei plasmidi e dei fagi temperati, di integrarsi in una molecola di DNA (nucleoide, plasmide o fago temperato) in qualsiasi regione e non solo omologa, possono cambiare il luogo della loro localizzazione nella molecola di DNA in cui si trovano sono integrati. Inoltre, possono anche “saltare” da una molecola di DNA all’altra.

A. I trasposoni vengono solitamente indicati come segue definizione: si tratta di sequenze nucleotidiche (da 2.000 a 20.000 coppie di nucleotidi) che possono cambiare la loro posizione in una molecola di DNA e migrare da una molecola di DNA a un'altra.

B. In una cellula batterica possono trovarsi in due stati.

1. Un trasposone può trovarsi in integrato condizione, cioè essere integrati in un replicone (nucleoide o plasmide) e, di conseguenza, replicarsi come parte di questo replicone.

2. Un trasposone può essere localizzato in una cellula batterica e in autonomo stato (cioè fuori dal replicone). In questo caso si chiude ad anello, ma, non potendo auto-replicarsi, durante la divisione cellulare passa in una sola delle due neoformate.

B. Trasposone consiste di di tre parti principali.

1. Contiene strutture terminali speciali, che distinguono il trasposone da altri frammenti di DNA presenti nella cellula batterica e sono, quindi, marcatori di questo particolare fattore extracromosomico di ereditarietà.

2. La capacità di un trasposone di cambiare la sua posizione in una molecola di DNA e di migrare da una molecola di DNA a un'altra è determinata da speciali geni di trasposizione(in realtà, queste sono sequenze IS).

3. Inoltre, il trasposone contiene geni determinazione della sintesi proteica, causando la presenza di caratteristiche aggiuntive nella cellula batterica contenente questo trasposone.

UN. Spesso tali geni determinano la capacità di una cellula batterica di sintetizzare l'una o l'altra proteina tossina.

B. Non meno spesso determina un trasposone sostenibilità cellule A Qualunque antibiotico(esattamente uno, a differenza del plasmide R).

V. Meno comunemente, un trasposone determina la sintesi delle proteine ​​che determinano altri segni.

11.7. Sequenze IS

Le sequenze IS (sequenze di inserimento) fanno parte del trasposone, garantendo la sua capacità di trasposizione.

R. Le sequenze IS vengono solitamente indicate come segue definizione: Si tratta di inserzioni di sequenze nucleotidiche (circa 1.000 paia di basi) capaci di trasposizione.

B. Le sequenze IS sono fondamentali diversi dai trasposoni.

1. In primo luogo, loro contengono solo geni di trasposizione.

2. In secondo luogo, loro non trovato in uno stato libero.

B. Le sequenze IS eseguono tre principali funzioni.

1. Con il loro aiuto viene effettuato il coordinamento interazioni di fattori extracromosomici di ereditarietà tra loro e con il cromosoma batterico per garantirne la ricombinazione.

2. Inoltre, possono svolgere funzione normativa(cioè regolare la trascrizione genetica “accendendola/spegnendola”).

3. Infine, le sequenze IS possono indurre mutazioni(inversioni, duplicazioni su 5-9 coppie di nucleotidi).

11.8. Meccanismi di conversione fagica

Qui, dopo aver presentato informazioni sul batteriofago e sui fattori extracromosomici dell'ereditarietà nei batteri, possiamo riassumere le informazioni sui meccanismi di conversione fagica (vedere sezione 10.4.B.2), quando, a seguito della lisogenizzazione (cioè integrazione nel genoma di un batteriofago temperato), il batterio acquisisce un segno aggiuntivo.

R. In primo luogo, questo fenomeno potrebbe essere dovuto a depressione del gene profago, come sopra menzionato (vedi paragrafo 10.4.B.2).

B. In secondo luogo, un tratto aggiuntivo può essere determinato dal genoma del batterio donatore, introdotto nel genoma del batterio ricevente da un fago difettoso quando trasduzione specializzata(Vedi sezione 10.4.B.2).

B. E in terzo luogo, se un batteriofago temperato si è integrato vicino al promotore danneggiato di uno dei geni, allora la funzione di questo promotore disfunzionale può essere “assunta” dal promotore del profago, ripristino in tal modo espressione gene “silenzioso” del batterio ricevente.

Informazioni correlate.

I batteri sono microrganismi procarioti, il cui materiale genetico è rappresentato principalmente da un singolo DNA circolare a doppio filamento, chiamato cromosoma dai genetisti. In casi relativamente rari, un cromosoma è rappresentato da una molecola di DNA lineare.

La dimensione di questo DNA è molto più grande della dimensione della cellula batterica stessa. Quindi, ad esempio, a Escherichia coli la lunghezza del DNA cromosomico è 1300 µm (1,3 mm - 4,6 x 10 6 bp) e la dimensione della cellula è 1,1-1,5 x 2,0-6,0 µm. Inoltre, il DNA non riempie l'intera cellula, ma è contenuto solo in un'area limitata, costituendo, molto approssimativamente, un terzo del volume cellulare.

Fig. 1. Genoma batterico e diagramma dei suoi livelli di compattazione.

Ne consegue che il DNA esiste in una cellula in uno stato altamente ordinato (condensato) sotto forma di una struttura compatta. Questa struttura, che ricorda vagamente i nuclei eucariotici, viene chiamata nucleoide ed è visibile al microscopio solo dopo colorazioni specifiche del DNA (Fig. 1). Al microscopio elettronico appare come una formazione costituita da numerose anse che si estendono da una densa regione centrale. Formazione di un gran numero (fino a 140 per genoma) di anse chiamate domini, è uno dei livelli di compattazione del DNA. Ciascun dominio è ancorato alla base da una molecola di RNA ed è formato da circa 40 kb. Le anse del DNA non hanno la forma di un duplex liberamente allungato, ma hanno un secondo livello di compattazione dovuto alla torsione in formazioni superelicoidali attraverso la connessione con le proteine ​​HLP.

Queste proteine ​​sono di piccole dimensioni, altamente basiche e si legano fortemente al DNA. Nella composizione aminoacidica assomigliano agli istoni eucariotici.

Il nucleoide non è separato dal citoplasma dalla membrana nucleare ma è attaccato ad essa mesosomi– invaginazioni specifiche della membrana citoplasmatica nella cellula. Il legame del DNA ad una regione specifica della membrana è necessario per il funzionamento del genoma.

La molecola circolare del DNA dei batteri (cromosoma) è una molecola genetica autoreplicante - replicone. La replica inizia con punti di inizio replicazione (ori– originale ) , localizzato, di regola, nel sito di attacco del DNA alla membrana. Dal punto di inizio, la replica avviene in modo sequenziale, bidirezionale, utilizzando un meccanismo semi-conservativo. La replica termina alle regione di terminazione della replica (ter), situato su una sezione di DNA circolare opposta all'origine della replicazione (Fig. 2).

Riso. 3. Distribuzione delle copie figlie del DNA e divisione cellulare batterica.

Il numero di cromosomi in una cellula batterica dipende dallo stadio di sviluppo e dalle condizioni fisiologiche della crescita della coltura. Nella fase di crescita logaritmica Escherichia coli per 1 nucleoide ci sono 2,8 equivalenti di DNA di un genoma, a causa della lenta segregazione di due cromosomi figli, o della ripresa di nuovi cicli di replicazione del DNA anche prima della divisione cellulare (Fig. 4).

Fig.4. Il numero di cromosomi in una cellula negli stadi stazionario (A) e logaritmico (B) della crescita della coltura.

In alcuni batteri, le cellule normalmente contengono non uno, ma molti cromosomi. Possono formare uno o più nucleoidi. Esiste anche una dipendenza del contenuto di DNA in una cellula dalle sue dimensioni, sebbene ciò non significhi un corrispondente cambiamento nel volume dell'informazione genetica.

Il DNA batterico è caratterizzato da un'elevata densità genetica (1 gene per 1 kb). Il DNA che codifica proteine ​​costituisce circa l’85-90% di tutto il DNA. La dimensione media delle sequenze di DNA tra i geni è di soli 110-125 bp. Il DNA batterico non codificante rappresenta meno dell'1% ed è solitamente presente sotto forma di trasposoni. Quindi, nel DNA del ceppo Escherichia coli La linea K12 MG 1655 ha trovato 41 copie di vari trasposoni (IS), che sono coinvolti nei processi di inserimento ed esclusione del plasmide. Molti fagi, anche se non completamente esclusi dal genoma batterico, lasciano lì come traccia alcuni dei loro geni. Questi resti, incapaci di movimento e sviluppo indipendenti, sono chiamati fagi “criptici”.

Gli introni sono estremamente rari nei genomi batterici. Esistono casi di sovrapposizione genetica, in cui un gene si trova all'interno di un altro sullo stesso filamento di DNA. I genomi batterici sono caratterizzati da operoni: Escherichia coli Il 27% delle unità di trascrizione previste sono operoni.

Una cellula batterica può contenere altri repliconi che possono esistere separatamente dal cromosoma batterico. Sono chiamati plasmidi. I plasmidi sono molecole di DNA circolari (in alcune specie lineari) a doppio filamento di varie dimensioni da 1000 bp. fino a quasi un terzo della dimensione del cromosoma batterico stesso. Il numero e la gamma di plasmidi nelle cellule batteriche possono variare. Differenze nello spettro dei plasmidi si osservano spesso anche tra cellule di ceppi diversi della stessa specie batterica. Alcuni plasmidi possono essere inseriti nel cromosoma batterico, costituendo parte del replicone batterico, e possono essere nuovamente esclusi da esso, ripristinando la forma di replicone autonomo. Tali plasmidi sono chiamati episodi.

I profagi possono anche essere inclusi nel materiale genetico dei batteri.

Indice dell'argomento "Valutazione della crescita batterica. Sporulazione da parte di batteri. Genetica dei batteri":
1. Crescita bifase dei batteri. Diauxia. Crescita senza divisione. Valutazione della crescita batterica. Valutazione quantitativa della crescita batterica.
2. Fattori che influenzano la crescita dei batteri. Terreni di coltura per la crescita batterica. Mezzi di coltura semplici e complessi. Terreni di coltura solidi e liquidi.
3. Temperatura di crescita batterica. Batteri mesofili. Batteri termofili. Batteri psicrofili. Aerazione dei batteri.
4. Il valore del pH richiesto per la crescita batterica. Pigmenti batterici. Tipi di pigmenti. Funzioni dei pigmenti batterici.
5. Sporulazione da parte di batteri. Spore batteriche. Sporangi. Endospore. Esospore.
6. Morfologia delle spore batteriche. La struttura di una spora batterica. Struttura di una spora batterica.
7. Sporulazione di batteri. Fasi della sporulazione nei batteri. Posizione delle spore nei batteri.
8. Germinazione delle spore batteriche. Attivazione delle spore. Forme di batteri dormienti (non coltivabili).

10. Fattori extracromosomici dell'eredità batterica. Plasmidi batterici. Tipi di plasmidi. Funzioni dei plasmidi batterici.

Al giorno d'oggi, la biologia molecolare può essere considerata un'area prioritaria delle scienze naturali. È strettamente correlato alla microbiologia e, in un certo senso, è il suo frutto, poiché utilizza batteri e virus come modelli principali e una delle aree principali della biologia molecolare è quella molecolare genetica- per molto tempo non è stata altro che la genetica di batteri e batteriofagi.

Studiando genetica dei batteri Ha anche un indubbio interesse applicativo, ad esempio, in termini di definizione dei meccanismi di trasmissione delle proprietà patogene e della resistenza ai farmaci.

I batteri sono un modello conveniente per ricerca genetica. Si distinguono per: la relativa semplicità della struttura del genoma, che consente di identificare mutanti con una frequenza pari o inferiore a 10 -9; aploidia, escluso il fenomeno della dominanza; differenziazione sessuale sotto forma di cellule donatrici e riceventi; la presenza di frammenti di DNA separati e integrati (plasmidi, trasposoni, ecc.); facilità di coltivazione e possibilità di ottenere popolazioni contenenti miliardi di corpi microbici.

Come altri organismi, la totalità dei geni in una cellula batterica lo è genoma- ne determina le proprietà e le caratteristiche ( genotipo). Fenotipo delle cellule batteriche- il risultato delle interazioni tra il batterio e l'ambiente - controlla anche il genoma (poiché le caratteristiche stesse sono codificate nei geni batterici).

Materiale genetico dei batteri

Strutture nucleari dei batteri hanno una struttura caratteristica che li distingue dai nuclei delle cellule eucariotiche; sono formati dai cosiddetti corpi cromatinici, o nucleoidi, privi di guscio e comprendenti la quasi totalità del DNA batterico.

Strutture nucleari possono essere osservati al microscopio a contrasto di fase, dove appaiono come aree meno dense di citoplasma. Per identificarli in strisci fissati è stata proposta la reazione di Feulgen-Rossenböck.

Nella crescita delle cellule batteriche nucleoidi si dividono attivamente, il loro numero a volte raggiunge 2-4.

Genoma procariotico

U batteri di solito ce n'è uno chiuso cromosoma ad anello, contenente fino a 4000 singoli geni necessari per mantenere l'attività vitale e la riproduzione dei batteri, cioè la cellula batterica è aploide e il raddoppio dei cromosomi è solitamente accompagnato dalla sua divisione.

Alcune specie (ad esempio Brucella melitensis) contengono stabilmente due cromosomi ad anello, altri (Leptospira interrogans) - un cromosoma circolare e un grande plasmide, altri - un cromosoma lineare (Streptomyces ambofaciens), cioè hanno genomi complessi.

Cromosoma batterico contiene fino a 5*10 6 paia di basi. Per confronto: genoma l'essere umano è 2,9 * 10 9 paia di basi. La lunghezza del cromosoma batterico nello stato spiegato è di circa 1 mm (Escherichia coli).

Alcuni batteri contengono molecole di DNA extracromosomico ( plasmidi) ed elementi trasponibili (plasmidi o cromosomi).