L'ossidazione microsomiale aumenta la reattività delle molecole. Citocromi P450 Inibitori del citocromo 450

Il citocromo p450 (CYP 450) è il nome di una vasta famiglia di enzimi universali del corpo umano, responsabili del metabolismo della maggior parte dei farmaci e di altri composti organici estranei (xenobiotici).

Il metabolismo di molte classi di farmaci (antistaminici, inibitori della proteasi retrovirale, benzodiazepine, bloccanti dei canali del calcio, ecc.) Si verifica con la partecipazione dei citocromi.

Inoltre, i citocromi mediano vari processi fisiologici, tra cui la biosintesi degli steroidi e del colesterolo, il metabolismo degli acidi grassi e il metabolismo del calcio (idrossilazione della vitamina D3, che è il primo passo nella formazione del calcitriolo).

Storia del citocromo p450

Il citocromo P450 fu scoperto alla fine degli anni '50 del XX secolo da M. Klingenberg e D. Garfinkel. Il termine “citocromo” (cito – cellula; chromos – colore) è apparso nel 1962 come nome temporaneo per una sostanza colorata presente nelle cellule.

Come si è scoperto, vari tipi di citocromo P450 sono ampiamente distribuiti nelle cellule di microrganismi, piante e mammiferi. Questi enzimi sono assenti solo nei batteri anaerobici.

Gli scienziati suggeriscono che tutti i geni che codificano diversi tipi di CYP450 discendono da un unico gene precursore che esisteva due miliardi di anni fa. La funzione di questo gene “originale” era quella di utilizzare energia. Attualmente in natura sono stati rinvenuti più di 1000 tipi diversi di citocromo CYP 450.

Diversità dei citocromi

Ad oggi sono stati scoperti circa 55 tipi diversi di citocromi nei mammiferi e più di 100 nelle piante.

Grazie ai successi dell'ingegneria genetica, è stato possibile stabilire che gli enzimi della famiglia dei citocromi svolgono varie funzioni, il che porta alla loro divisione in tre classi principali:

coinvolto nel metabolismo di farmaci e xenobiotici;
coinvolto nella sintesi degli steroidi;
partecipare ad altri importanti processi endogeni che si verificano nel corpo.

Classificazione dei citocromi

Tutti i citocromi e i geni che codificano per la loro sintesi sono denominati in conformità con le seguenti raccomandazioni:

il nome del citocromo deve includere la radice CYP;
è presente anche il nome del gene che codifica per la sintesi del corrispondente citocromo CYP , ma scritto in corsivo;
i citocromi sono divisi in famiglie (indicate da numeri), sottofamiglie (indicate da lettere) e isoforme (indicate da numeri che riflettono il numero del gene codificante).

Ad esempio, CYP 2 D 6 appartiene alla 2a famiglia, sottofamiglia D, codificata dal gene 6. Il nome del gene stesso assomiglia a CYP 2 D 6.

Citocromi basici

Nonostante la diversità dei citocromi nel corpo umano, metabolismo dei farmaci si verifica con la partecipazione di una quantità prevalentemente limitata di CYP 450. I rappresentanti più comuni di questo gruppo sono: CYP 1A2, CYP 2C9, CYP 2C19, CYP 2 D 6, CYP 2E1, CYP 3A4.

Questi enzimi catalizzano una vasta gamma di reazioni metaboliche:

un citocromo può metabolizzare diversi farmaci con strutture chimiche diverse;
lo stesso farmaco può essere influenzato da diversi CYP 450 in diversi organi e sistemi del corpo umano.

Dualità della natura dei citocromi P450

Nella maggior parte dei casi, i farmaci liposolubili e altre sostanze chimiche vengono trasformati in metaboliti idrosolubili, che vengono eliminati più facilmente dall’organismo. L'introduzione di gruppi idrossilici (grazie al citocromo P450) aumenta la polarità delle molecole e la loro solubilità, contribuendo anche alla loro eliminazione dall'organismo. Quasi tutti gli xenobiotici che entrano nel fegato vengono ossidati da alcune isoforme del citocromo p450.

Tuttavia, gli stessi enzimi che catalizzano i processi di “purificazione” possono attivare molecole chimiche inerti portandole a uno stato altamente reattivo. Tali molecole intermedie possono interagire con proteine e DNA.

Pertanto, l’effetto del citocromo p450 può avvenire attraverso uno dei due percorsi competitivi: disintossicazione o attivazione metabolica.

Variabilità dell'azione dei citocromi

Ogni persona ha il proprio metabolismo delle sostanze medicinali, diverso da quello delle altre persone. Le caratteristiche individuali dipendono da fattori genetici, età del paziente, sesso, stato di salute, dieta, farmacoterapia concomitante, ecc.

La variabilità genetica nel metabolismo dei farmaci è stata scoperta per caso: dosi standard di farmaci hanno causato inaspettatamente reazioni insolite in diversi individui.

L'attività enzimatica è di due (a volte tre) tipi principali: intenso e debole (medio), rispettivamente, il metabolismo delle sostanze medicinali può avvenire rapidamente e lentamente.

Citocromi e metabolismo dei farmaci

Citocromo CYP 1A2 è coinvolto nel metabolismo di molti farmaci, tra cui l'aminofillina e la caffeina. L'attività di questo enzima aumenta sotto l'influenza delle sostanze chimiche che entrano nel corpo umano durante il fumo.

Citocromo CYP 2A6 svolge un ruolo importante nel metabolismo della cumarina (un anticoagulante indiretto) e della nicotina.

Citocromo CYP 2S9 coinvolto nel metabolismo di fenitoina, tolbutamide, warfarin. Se almeno un amminoacido cambia nella struttura del gene che codifica per la sintesi di questo citocromo, la sua attività enzimatica viene interrotta. Il deficit enzimatico di questo citocromo provoca una predisposizione congenita all'intossicazione da fenitoina e complicazioni derivanti dalla terapia con warfarin.

Citocromo CYP 2S19 partecipa al metabolismo di omeprazolo, diazepam, imipramina. Tuttavia, il significato clinico di questo polimorfismo enzimatico rimane controverso. Le dosi efficaci di molti farmaci metabolizzati dal CYP 2C9 sono così lontane dall'essere tossiche che potenziali deviazioni nell'attività del citocromo CYP 2C9 non svolgono un ruolo significativo.

Citocromo CYP 2 D 6 è un esempio di differenze genotipiche tra diversi gruppi etnici. Negli anni '70 del secolo scorso fu studiata la farmacocinetica del farmaco antipertensivo detritiochina e del farmaco antiaritmico sparteina. Sono stati ottenuti i seguenti risultati: con una tendenza generale al metabolismo ultrarapido della detritiochina, tra i caucasici è stato osservato un metabolismo lento nel 5-10% dei casi, tra i giapponesi questa cifra era inferiore all'1%.

I farmaci metabolizzati dal CYP2D6 (betabloccanti, antiaritmici, psicoanalettici, antidepressivi e analgesici narcotici) hanno un indice terapeutico ristretto, vale a dire C’è poca differenza tra la dose necessaria per ottenere un effetto terapeutico e la dose tossica. In una situazione del genere, le deviazioni individuali nel metabolismo dei farmaci possono svolgere un ruolo drammatico: un aumento della concentrazione del farmaco a un livello tossico o una diminuzione fino alla perdita di efficacia.

La storia dell'uso della peresilina (Australia) ha chiaramente dimostrato l'enorme significato del polimorfismo CYP2D6. Dopo la prima esperienza di prescrizioni, il farmaco è stato rimosso dall'arsenale di farmaci per il trattamento dell'angina pectoris a causa dell'elevata epatotossicità e nefrotossicità. Ma attualmente la peresilina viene nuovamente utilizzata ed è riconosciuta come un agente altamente efficace, poiché è tossica solo per i pazienti con scarso metabolismo del CYP2D6. La sicurezza della prescrizione della peresilina è garantita dalla determinazione preliminare del livello individuale di questo citocromo.

Citocromo CYP 3A4 presumibilmente metabolizza circa il 60% di tutti i farmaci. Questo è il principale citocromo del fegato e dell'intestino (costituisce il 60% del numero totale di citocromi). La sua attività può aumentare sotto l'influenza di rifampicina, fenobarbital, macrolidi e steroidi.

Inibizione del metabolismo dei farmaci

L’inibizione del metabolismo dei farmaci è la causa più comune di interazioni farmacologiche clinicamente significative, con conseguenti aumenti indesiderati delle concentrazioni del farmaco nel sangue. Ciò si verifica più spesso quando due farmaci diversi competono per legarsi allo stesso enzima. Un farmaco che “perde” in questa “lotta” competitiva perde la capacità di essere adeguatamente metabolizzato e si accumula eccessivamente nell’organismo. È gratificante che non ci siano molti farmaci che hanno le caratteristiche di un inibitore pronunciato. Gli inibitori tipici sono cimetidina, eritromicina, ketoconazolo e chinidina. Tra i farmaci più recenti, gli inibitori selettivi della ricaptazione della serotonina e gli inibitori della proteasi hanno potenziali proprietà inibitorie.

Il tasso di inibizione dipende dalle proprietà farmacocinetiche dei farmaci “in conflitto”. Se sia l'inibitore che il farmaco substrato hanno un'emivita breve (ad esempio, la cimetidina e l'inibitore del suo metabolismo, la teofillina), l'interazione sarà massima nei giorni 2-4. Sarà necessario lo stesso tempo affinché l'effetto dell'interazione cessi.

In caso di uso simultaneo di warfarin e amiodarone, sarà necessario 1 mese o più per interrompere l'effetto inibitorio, associato alla lunga emivita di quest'ultimo.

Nonostante l’inibizione del metabolismo mediato dal citocromo costituisca un grosso problema, nella pratica clinica talvolta si creano le condizioni che consentono un utilizzo mirato di questo fenomeno. Il farmaco antivirale saquinavir ha una biodisponibilità molto bassa, che è associata al suo ampio metabolismo da parte del citocromo CYP 3A4. La biodisponibilità del farmaco se assunto per via orale è solo del 4%. La somministrazione concomitante del farmaco correlato ritinavir, che inibisce l'attività del citocromo, determina un aumento di 50 volte delle concentrazioni plasmatiche di saquinavir, che consente un effetto terapeutico.

Induzione del metabolismo dei farmaci

L'induzione del metabolismo si verifica quando un farmaco stimola la sintesi di enzimi coinvolti nel metabolismo di un altro farmaco (o riduce la naturale degradazione di questi enzimi).

L'induttore del citocromo più noto è la rifampicina, che aumenta i livelli di CYP 3A4 e CYP 2C nel fegato, con conseguente intensificazione del metabolismo di numerosi farmaci (tabella).

È abbastanza ragionevole supporre che gli induttori del citocromo riducano l’efficacia dei substrati dei farmaci. Tuttavia, c’è un altro aspetto di questo fenomeno. La brusca interruzione di un farmaco induttore (o la cessazione dell’esposizione ambientale a un induttore) può inaspettatamente provocare un notevole aumento delle concentrazioni plasmatiche di un farmaco che era stato precedentemente ampiamente metabolizzato. Un esempio è una situazione in cui i fumatori, abituati a bere costantemente caffè, decidono improvvisamente di smettere di fumare, a seguito della quale l'attività del CYP 1A2 diminuisce e aumenta la concentrazione di caffeina nel plasma sanguigno. Ciò può aggravare la gravità dei sintomi di astinenza: mal di testa e agitazione.

Interazione dei citocromi con il cibo

Uno studio del 1991 ha rilevato che un bicchiere di succo di pompelmo ha causato un aumento di tre volte dei livelli plasmatici di felodipina. Tuttavia, altri succhi non hanno causato un effetto simile. Si presume che i componenti del pompelmo - flavonoidi o furanocumarina - sopprimano il metabolismo della felodepina nell'intestino, mediato dal citocromo CYP 3A4.

La farmacogenomica e le sue promettenti direzioni

La scienza che studia la risposta geneticamente determinata dell'organismo ai farmaci è stata recentemente chiamata farmacogenomica. Lo sviluppo di questa scienza consentirà di prevedere con precisione la risposta individuale del corpo a un trattamento specifico, nonché di identificare i pazienti ad alto rischio di sviluppare reazioni tossiche.

Tavolo. I principali tipi di citocromo p450 nell'uomo

Citocromo	Substrati interessati	Inibitore	Induttore
	Amitriptilina, caffeina, clomipramina, imipramina, clozapina, mexiletina, estradiolo, paracetamolo, propranololo, tacrina, teofillina, R-warfarin	Cimetidina, fluvoxamina, antibiotici fluorochinolonici (ciprofloxacina, norfloxacina), succo di pompelmo	Omeprazolo, fenobarbital, fenitoina, bicarbonati policiclici aromatici (es. kebab), fumo di sigaretta
	Diclofenac, indometacina, losartan, naprossene, fenitoina, piroxicam, tolbutamide, S-warfarin	Amiodarone, cloramfenicolo, cimetidina, fluconazolo, fluoxetina, isoniazide, omeprazolo, sertralina, sulfinpirazone	Rifampicina
	Clomipramina, clozapina, diazepam, imipramina, lansoprazolo, omeprazolo, fenitoina, propranololo	Fluoxetina, fluvoxamina, isoniazide, omeprazolo, sertralina	Rifampicina
	Amitriptilina, clorpromazina, clomipramina, clozapina, codeina, desipramina, destrometorfano, doxepina, fluoxetina, aloperidolo, imipramina, labetalolo, metadone, metoprololo, procainamide, prometazina, propafenone, propranololo, tioridazina, timololo	Amiodarone, cimetidina, aloperidolo, mibefradil, chinidina, propafenone, tutti gli inibitori della ricaptazione della serotonina
	Caffeina, etanolo, paracetamolo, teofillina	Cimetidina, disulfiram	Etanolo, isoniazide
	Amiodarone, amitriptilina, atorvastatina, buprenorfina, carbamazepina, claritromicina, clomipramina, clonazepam, cocaina, cortisolo, ciclofosfamide, ciclosporina, desametasone, digitossina, diltiazem, diazepam, doxorubicina, eritromicina, felodipina, fentanil, imipramina, ketoconazolo, micon azolo, midazolam, nifedipina , estradiolo, omeprazolo, propafenone, chinidina, simvastatina, teofillina, verapamil, vincristina, warfarin	Amiodarone, cannabinoidi, cimetidina, claritromicina, clotrimazolo, diltiazem, eritromicina, succo di pompelmo, ketoconazolo, metronidazolo, miconazolo	Carbamazepina, glucocorticoidi, fenitoina, rifampicina, sulfadimidina

L'ossidazione microsomiale è una sequenza di reazioni che coinvolgono ossigenasi E NADPH, portando all'introduzione di un atomo di ossigeno nella composizione di una molecola non polare e alla comparsa di idrofilicità in essa e all'aumento della sua reattività.

Reazioni ossidazione microsomiale effettuata da numerosi enzimi localizzati sulle membrane del reticolo endoplasmatico (nel caso in vitro sono chiamate membrane microsomiali). Gli enzimi organizzano catene corte che terminano con il citocromo P 450.

Le reazioni di ossidazione microsomiale includono alle reazioni della fase 1 e hanno lo scopo di conferire proprietà polari a una molecola idrofoba e/o di aumentarne l'idrofilicità, migliorando la reattività delle molecole per partecipare alle reazioni di fase 2. Nelle reazioni di ossidazione si verifica la formazione o il rilascio di gruppi idrossilici, carbossilici, tiolici e amminici, che sono idrofili.

Gli enzimi di ossidazione microsomiale si trovano nel reticolo endoplasmatico liscio e sono ossidasi a funzione mista(monoossigenasi).

Citocromo P450

La principale proteina dell'ossidazione microsomiale è l'emoproteina - citocromo P450. In natura esistono fino a 150 isoforme di questa proteina, che ossidano circa 3000 substrati diversi. Il rapporto tra le diverse isoforme del citocromo P450 varia a causa delle caratteristiche genetiche. Si ritiene che alcune isoforme siano coinvolte nella biotrasformazione degli xenobiotici, mentre altre metabolizzano composti endogeni (ormoni steroidei, prostaglandine, acidi grassi, ecc.).

Citocromo P450 interagisce con l'ossigeno molecolare e include un atomo di ossigeno nella molecola del substrato, contribuendo alla comparsa (aumento) della sua idrofilia, e l'altro nella molecola d'acqua. Le sue reazioni principali sono:

dealchilazione ossidativa, accompagnata dall'ossidazione del gruppo alchilico (agli atomi di N, O o S) ad aldeide e dalla sua eliminazione,
ossidazione (idrossilazione) di composti non polari con anelli alifatici o aromatici,
ossidazione degli alcoli alle corrispondenti aldeidi.

Il lavoro del citocromo P 450 è assicurato da due enzimi:

NADH-citocromo b 5 ossidoreduttasi, contiene FAD,
NADPH-citocromo P 450 ossidoreduttasi, contiene FMN E FAD.

Schema delle posizioni relative degli enzimi di ossidazione microsomiale e delle loro funzioni

Entrambe le ossidoreduttasi ricevono elettroni dai corrispondenti equivalenti ridotti e li trasferiscono al citocromo P 450. Questa proteina, avendo precedentemente attaccato una molecola del substrato ridotto, si lega ad una molecola di ossigeno. Dopo aver ricevuto un altro elettrone, il citocromo P 450 incorpora il primo atomo di ossigeno nel substrato idrofobico (ossidazione del substrato). Allo stesso tempo avviene la riduzione del secondo atomo di ossigeno in acqua.

Sequenza di reazioni di idrossilazione dei substrati con la partecipazione del citocromo P450

Una caratteristica essenziale dell’ossidazione microsomiale è la capacità di indurre o inibire, ad es. ad una variazione della potenza del processo.

Gli induttori sono sostanze che attivano la sintesi del citocromo P 450 e la trascrizione del corrispondente mRNA. Sono

1. Ampio spettro azioni che hanno la capacità di stimolare la sintesi del citocromo P 450, della NADPH-citocromo P 450 ossidoreduttasi e della glucuronil transferasi. I rappresentanti classici sono derivati dell'acido barbiturico - barbiturici, Questo gruppo include anche diazepam, carbamazepina, rifampicina e così via.

2. Spettro ristretto e azioni, ad es. stimolare una delle forme del citocromo P 450 - idrocarburi policiclici aromatici ( metilcolantrene, spironolattone), etanolo.

Per esempio, etanolo stimola la sintesi dell'isoforma P 450 2E1 (alcol ossidasi), coinvolta nel metabolismo di etanolo, nitrosammine, paracetamolo, ecc.
Glucocorticoidi inducono l'isoforma P 450 3A.

Gli inibitori dell'ossidazione microsomiale si legano alla parte proteica del citocromo o del ferro eme. Si dividono in:

1. Reversibile

direttoAzioni- monossido di carbonio ( CO), antiossidanti,
indirettoAzioni, cioè. influenza attraverso prodotti intermedi del loro metabolismo, che formano complessi con il citocromo P 450 - eritromicina.

2. Irreversibile inibitori – allopurinolo, aminazina, progesterone, orale contraccettivi, teturam, fluorouracile,

Valutazione delle reazioni di fase 1

L'ossidazione microsomiale può essere valutata nei seguenti modi:

determinazione dell'attività degli enzimi microsomiali dopo la biopsia,
sulla farmacocinetica dei farmaci,
utilizzando marcatori metabolici ( test dell'antipirina).

Test dell'antipirina

Il soggetto lo assume al mattino a stomaco vuoto amidopirina alla velocità di 6 mg/kg di peso corporeo. Vengono raccolte 4 porzioni di urina nell'intervallo rispettivamente da 1 a 6 ore, 6-12, 12-24 e 45-48 ore. Viene misurato il volume delle urine. Entro e non oltre 24 ore dopo, l'urina viene centrifugata o filtrata. Successivamente, viene esaminata la concentrazione della 4-aminoantipirina e del suo metabolita N-acetil-4-aminoantipirina nelle urine.

I citocromi P 450 (EC 1. 14. 1) sono una famiglia di monoossigenasi contenenti eme che metabolizzano gli xenobiotici, compresi i farmaci. Localizzato nel reticolo endoplasmatico liscio della cellula, aperto - D. Garfinkel, M. Klingenberg, 1958.

Citocromo P 450 (inglese Cytochrome P 450, CYP) Il nome indica che è colorato (P - dall'inglese Pigment). Il citocromo P 450, legato al monossido di carbonio, ha un massimo di assorbimento della luce alla lunghezza d'onda di 450 nm, da cui il nome (T. Omura e R. Sato nel 1964). La CO non ha nulla a che fare con la funzione del P 450. Viene aggiunta per facilitare la determinazione del contenuto di P 450 mediante l'intensità dello spettro di assorbimento.

L'uso del termine "citocromo" in relazione alle emoproteine della classe P 450 non può essere considerato un successo, poiché la funzione dei citocromi è il trasferimento di elettroni e non la catalisi delle reazioni della monoossigenasi. Il citocromo P-450 appartiene ai citocromi di tipo b. Il precursore dell'eme è la protoporfirina IX.

Peso molecolare delle varie cit. R 450 varia da 44 a 60 k. I monomeri dell'emoproteina sono costituiti da una catena polipeptidica contenente dal 45 al 55% di residui di amminoacidi non polari. La sequenza aminoacidica completa è stata stabilita per più di 150 cit. P 450. Utilizzando la cristallografia a raggi X, la struttura tridimensionale di cit. P 450 da P. putida. La proteina contiene 414 residui aminoacidici, M. m. - 47 k Sì, è un prisma asimmetrico con una base di 3,0 nm e lati di 5,5 e 6,0 nm.

Citazione P 450 di P. putida contiene 4 regioni elicoidali antiparallele, una miscela di eliche e strutture disordinate intervallate da strutture beta parallele. L'eme si trova tra due eliche parallele. I residui Arg-112, Arg-229 e His-335 interagiscono con i gruppi propionici dell'eme. Gli altri amminoacidi che circondano l'eme non sono polari. L'eme non raggiunge la superficie della molecola. La distanza più breve dalla superficie all'eme è di circa 0,8 nm.

Tutti i citocromi di membrana P 450 sul frammento N-terminale della catena peptidica hanno una breve regione idrofobica contenente da 12 a 21 residui aminoacidici. Agisce come un peptide di ancoraggio e contiene una sequenza segnale responsabile dell'inserimento della proteina nella membrana. Dietro di esso c'è una sequenza di segnali di arresto che interrompe l'incorporazione del peptide nel doppio strato fosfolipidico.

I citocromi P 450 sono assenti solo negli organismi anaerobi obbligati. Almeno 11.500 descritti? proteine del sistema Cyt. I batteri P 450 e gli archaea sono disciolti nel citoplasma. Il passaggio ai sistemi eucariotici è stato accompagnato dall'incorporazione del P450 nella membrana. Tutto cit. P 450 degli organismi superiori sono enzimi di membrana. In termini evolutivi, la monoossigenasi batterica è la più antica.

Sistema cit. Il P 450 è coinvolto nell'ossidazione di numerosi composti, sia endogeni che esogeni. Citazione Le monoossigenasi dipendenti da P450 catalizzano la scomposizione di varie sostanze con la partecipazione di un donatore di elettroni e ossigeno molecolare. In questa reazione, un atomo di ossigeno viene aggiunto al substrato e il secondo viene ridotto ad acqua. Il centro di legame dell'ossigeno è altamente specifico, il centro di legame del substrato convertito è relativo.

Gli enzimi della famiglia del citocromo P 450 sono diversi e differiscono: per funzioni, tipi di attività enzimatica, regolatori dell'attività (inibitori, induttori). Singole isoforme (isoenzimi) cit. I P-450 hanno una certa specificità e ciascuno di essi è coinvolto nel metabolismo di un numero relativamente piccolo di sostanze.

Il citocromo P 450, insieme all'attività della monoossigenasi, può esibire attività ossidasica (A.I. Archakov et al.), cioè catalizzare la rimozione dell'idrogeno dal substrato, utilizzando l'ossigeno come accettore di idrogeno e riducendolo ad acqua, o generando forme attive di ossigeno sotto forma di superossido e radicali idrossilici, perossido di idrogeno. Il P 450 mostra attività perossidasica utilizzando perossidi organici o perossido di idrogeno come cosubstrati nelle reazioni di ossidazione invece del NADPH. Esistono prove che il P 450 può catalizzare le reazioni della diossigenasi e introdurre due atomi di ossigeno nella sostanza ossidata. Pertanto, una caratteristica del P 450 è la sua molteplicità di funzioni, ma la principale è la monoossigenasi.

Citazione I P-450 sono codificati da una superfamiglia di geni. Nel sistema della persona cit. Il P-450 ha identificato 57 geni e più di 59 pseudogeni (analoghi non funzionali di geni strutturali che hanno perso la capacità di codificare proteine e non sono espressi nella cellula. Il termine “pseudogene” è stato proposto per la prima volta nel 1977). Nebert (1987) ha sviluppato una classificazione cit. P-450, basato sull'evoluzione divergente e sull'omologia delle sequenze nucleotidiche/amminoacidiche. La superfamiglia è divisa in 18 famiglie e 43 sottofamiglie. Nomenclatura dei geni cit. Il P-450 umano è descritto in dettaglio.

Attualmente sono note migliaia di isoforme (isoenzimi) di cyt. R-450. Le isoforme con più del 40% della composizione totale di aminoacidi sono raggruppate in famiglie e sono designate con numeri arabi (CYP 1, CYP 2, CYP 3, ecc.). Le sottofamiglie sono designate con lettere latine e combinano isoforme con un'identità di composizione aminoacidica superiore al 55% (CYP 2 D, CYP 3 A, ecc.). Nella sottofamiglia, le singole isoforme sono designate con numeri arabi che seguono le lettere latine (CYP 1 A 2, CYP 2 D 6 , CYP 3 A 4). Uno xenobiotico può essere un substrato di due o più isoforme. Diverse isoforme sono in grado di metabolizzare una sostanza in diverse parti della sua molecola

Citazione P 450 catalizzano la ω-ossidazione degli acidi grassi saturi (FA), perossidazione degli acidi grassi insaturi. a., idrossilazione degli ormoni steroidei, degli acidi biliari e del colesterolo, biosintesi delle prostaglandine (localizzate nei mitocondri, sulla membrana nucleare). I microsomi del citocromo P 450 sono coinvolti nella biotrasformazione metabolica degli xenobiotici (farmaci, veleni, sostanze narcotiche). Le isoforme delle famiglie I, II e III prendono parte al metabolismo dei farmaci, di cui le principali sono IA 1, 1 A 2, 2 A 6, 2 B 6, 2 D 6, 2 C 9, 2 C 19, 2 E 1 , 3A4 .

Induttori comuni Enzimi Induttore del fenobarbitolo Metalli pesanti l Sistema del citocromo P 450 Induttore Farmaci antitumorali Metilcolantrene Sistema del citocromo P 448 Epossido idrolasi Glutatione e UDPglucuroniltransferasi Sintesi di GSH Metallotioneine P-glicoproteina Induttore

Il fenobarbital attiva la sintesi del cit. P 450, UDPglucuroniltransferasi ed epossido idrolasi. Ad esempio, negli animali a cui è stato somministrato l'induttore fenobarbital, aumenta l'area delle membrane dell'ER, che raggiunge il 90% di tutte le strutture di membrana della cellula, e, di conseguenza, un aumento del numero di enzimi coinvolti nella neutralizzazione di xenobiotici o sostanze tossiche di origine endogena. L'uso simultaneo di fenobarbital e alcuni farmaci che metabolizzano con la partecipazione di cit. P 450, porta ad una diminuzione dell'efficacia di questi ultimi a causa della trasformazione della molecola nel processo di biotrasformazione o della loro rapida rimozione dal corpo.

Attualmente sono stati descritti più di 250 composti chimici che causano l'induzione di enzimi microsomiali. Gli induttori dei sistemi di monoossigenasi sono divisi in due classi. I rappresentanti della prima classe (insetticidi, etanolo, ecc.) Causano una pronunciata proliferazione del reticolo endoplasmatico liscio negli epatociti e un aumento dell'attività del citocromo P 450. Stimolazione del metabolismo causata da induttori della seconda classe (IPA - idrocarburi policiclici aromatici : tetraclorodibenzodiossina, 3-metilcolantrene, benz(a) pirene, ecc., non è accompagnato dalla proliferazione del reticolo endoplasmatico liscio, ma l'attività di molti enzimi di biotrasformazione aumenta in modo significativo. L'aumento del metabolismo della maggior parte degli xenobiotici porta ad una diminuzione della tossicità At allo stesso tempo, la tossicità di alcuni xenobiotici aumenta in modo significativo sotto l'influenza di induttori. Ad esempio, aumenta la tossicità del tetracloruro di carbonio, del gas senape, ecc.

Esistono sostanze chimiche che possono inibire sia gli enzimi della prima fase della biotrasformazione (isoenzimi del citocromo P-450) che della seconda fase della biotrasformazione (N-acetiltransferasi, ecc.), nonché i trasportatori della terza fase (PATPasi). Con una diminuzione dell'attività degli enzimi metabolici, è possibile lo sviluppo di effetti collaterali associati alla circolazione prolungata di questi composti nel corpo. L'inibizione dei trasportatori, così come la loro induzione, può portare a vari cambiamenti (principalmente un aumento) della concentrazione di xenobiotici nel plasma sanguigno, a seconda delle funzioni di un determinato trasportatore.

Catene di trasporto degli elettroni La catena ER 1 comprende: 1) citocromo P 450, ha centri leganti per O 2 e un substrato idrofobo; 2) NADPH-citocromo P 450 reduttasi contenente i coenzimi FAD e FMN; 3) NADPH+H+ è un donatore di ē e H+ in questa catena di trasporto degli elettroni; 4) La catena O 2. 2 comprende: 1) citocromo P 450; 2) l'enzima NADH-citocromo b 5 reduttasi, il cui coenzima è FAD; 3) citocromo b 5 – emoproteina che trasferisce ē dalla NADH-citocromo b 5 reduttasi al citocromo P 450; 4) NADH + H+ – donatore di ē e H+; 5) O 2. Il citocromo P 450 include un atomo di O 2 nella molecola del substrato, e il 2° viene ridotto per formare H 2 O a causa del trasferimento di ē e H+ da NADPH+H+ con la partecipazione della citocromo P 450 reduttasi (o da NADH+ H+ tramite citocromo b 5 reduttasi e citocromo b 5).

Un altro diagramma dell'organizzazione della catena di trasporto degli elettroni dell'ER. La fonte di elettroni e protoni nella catena è NADPH + H +, che si forma nelle reazioni della via del pentoso fosfato dell'ossidazione del glucosio. L'accettore intermedio di H+ ed e- è una flavoproteina contenente il coenzima FAD (citocromo P 450 reduttasi). L'ultimo anello della catena di ossidazione microsomiale è il citocromo P 450, che riduce l'ossigeno in acqua. Funzionamento del sistema cit. L'R-450 è associato al funzionamento della cit. b-5, la fonte di elettroni e protoni in cui si trova NADH + H +, formato nella glicolisi. L'accettore intermedio di H+ ed e- è una flavoproteina contenente il coenzima FAD (citocromo b-5 reduttasi).

Esempio RH – substrato cit. R-450; le frecce indicano le reazioni di trasferimento degli elettroni. Forma restaurata cit. -b 5 ossida lo stearoil-Co. A-monoossigenasi, che trasferisce gli elettroni all'O₂. Un atomo di O₂ prende 2 e¯ e passa nella forma O²¯. Il donatore di elettroni è il NADPH, che viene ossidato dal NADPH-cyt. P-450 reduttasi. O²¯ interagisce con i protoni per formare O²¯ + 2 Н⁺ → Н₂О Il secondo atto dell'ossigeno è incluso nel substrato RH, formando il gruppo ossidrile della sostanza R-OH.

NADP-H-citocromo P-450 reduttasi – flavoproteina. Una mole dell'enzima contiene una mole ciascuna di flavina mononucleotide (FMN) e flavina adenina dinucleotide (FAD). Poiché il citocromo C può fungere da accettore di elettroni (utilizzato in sistemi modello), questo enzima è spesso chiamato NADP-citocromo reduttasi.

Il meccanismo di idrossilazione del substrato con la partecipazione del citocromo P-450 Convenzionalmente si possono distinguere 5 fasi: 1. la sostanza ossidata (S) forma un complesso con la forma ossidata del citocromo P-450; 2. questo complesso viene ripristinato da un elettrone del NADPH; 3. il complesso ridotto si combina con una molecola di O2; 4. L'O 2 come parte del complesso attacca un altro elettrone al NADPH; 5. il complesso si decompone per formare una molecola di H2O, una forma ossidata del citocromo P-450 e un substrato idrossilato (S-OH).

A differenza della catena respiratoria mitocondriale, la catena della monoossigenasi non accumula energia sotto forma di ATP durante il trasferimento degli elettroni. L'ossidazione microsomiale è l'ossidazione libera. Nella maggior parte dei casi, l'idrossilazione delle sostanze estranee ne riduce la tossicità. Tuttavia si possono formare prodotti con proprietà citotossiche, mutagene e cancerogene.

I citocromi P-450 sono proteine di membrana e lo studio della loro attività catalitica richiede una complessa ricostruzione del sistema monoossigenasi utilizzando partner redox e fosfolipidi. Inoltre, gli isoenzimi cit. I P-450 vengono rapidamente disattivati. Il metodo di analisi elettrochimica ha notevolmente semplificato la determinazione dell'attività cit. R-450. I primi lavori dedicati all'uso di un elettrodo come donatore di elettroni per la catalisi del cit. R-450 (CYP 3 A 4): Kuznetsov B. A., Mestechkina N. M., Izotov M. V., Karuzina I. I., Karyakin A. V., Archakov A. I. (1979) Biochemistry, 44, 1569 -1574. Archakov A. I., Kuznetsov B. A., Izotov M. V., Karuzina I. I. (1981) Biofisica, 26, 352 -354.

Attualmente sono stati sviluppati sistemi di biosensori elettrochimici basati su citocromi P-450 immobilizzati su un elettrodo. La reazione elettrocatalitica viene avviata dagli elettroni provenienti dall'elettrodo. Ciò elimina la necessità di utilizzare partner redox del sistema monoossigenasi e equivalenti riducenti del NADPH. Determinazione dell'attività catalitica del cit immobilizzato. L'R-450 viene effettuato registrando la corrente catalitica che si verifica quando un substrato viene introdotto nel sistema elettrochimico. La registrazione della corrente catalitica viene effettuata utilizzando metodi voltammetria o amperometria e consente di calcolare molte caratteristiche del processo enzimatico: la costante di Michaelis-Menten, la costante catalitica elettrochimica.

Dipendenza delle variazioni della corrente catalitica durante la titolazione ampermetrica cit. P-450 3 A 4 (CYP 3 A 4) con testosterone a una tensione controllata E = -0,5 V (rispetto ad Ag/Ag. Cl). Nel riquadro è riportato il calcolo dei Km elettrochimici [testosterone]. (VV Shumyantseva et al., 2015)

Lo sviluppo di biosensori basati su sistemi elettrochimici contenenti citocromo P 450 consente di identificare substrati (xenobiotici), studiare gli effetti dei farmaci sull'attività catalitica di specifiche isoforme del citocromo P 450. L'obiettivo è creare dispositivi sensore adatti all'uso nella medicina personalizzata, per condurre esperimenti per studiare l'effetto dei farmaci sull'attività del CYP nei sistemi elettrodo/citocromo P 450.

Vantaggi del metodo elettrochimico per lo studio del sistema monoossigenasi del citocromo P 450 1) il sistema elettrochimico non richiede l'uso di equivalenti riducenti costosi e instabili di NADPH e NADH, poiché viene utilizzata una fonte alternativa di elettroni: un elettrodo; 2) non richiede una ricostruzione completa del sistema monoossigenasi (utilizzo di tutti i componenti del sistema microsomiale e delle proteine partner redox del ciclo catalitico del citocromo P 450); 3) il metodo è altamente sensibile e consente l'uso di una quantità minima di enzima costoso (fino a 10 -12 µmol di proteina/elettrodo); 4) l'elettrocatalisi e la controllabilità del processo enzimatico mediante corrente elettrica sono altamente efficaci; 5) è possibile prevenire l'inattivazione delle isoforme P450 intatte utilizzando vari modificatori superficiali degli elettrodi sintetici.

Metodi per valutare lo stato del sistema di biotrasformazione xenobiotica: 1) Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). Permette di studiare gli analiti nell'urina, nel sangue, nella saliva e in altro materiale biologico dopo la somministrazione di uno xenobiotico (sostanza medicinale). È possibile eseguire l'analisi cinetica per determinare l'emivita del farmaco in esame, il volume di distribuzione apparente, la clearance di eliminazione e altri parametri. Un analita è un componente o una caratteristica di un campione da misurare. Questo concetto include qualsiasi elemento: ione, composto, sostanza, fattore, agente infettivo, cellula, organello, attività (enzimatica, ormonale, immunologica) o segno: presenza o assenza, concentrazione, attività, intensità o altre caratteristiche che devono essere determinate. Il concetto è stato formulato dal Comitato nazionale statunitense per gli standard di laboratorio clinici (NCCLS, documento NRSCL 8 -A). Accanto ai termini usiamo “indicatore di laboratorio”, “parametro”, “test”, ecc.

2) Analisi PCR-RFLP del polimorfismo e delle forme mutanti dei geni cyt. R-450. W; Risultati dell'analisi del polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (analisi RFLP) del gene CYP 1 A 2: 1 – marcatore del peso molecolare; 2, 4, 6, 7, 8, 10 e 11 – genotipo mutante – M (mutazione nel sito di restrizione – la restrizione non si verifica); 3 – nessuna mutazione – genotipo wild type – 5 e 9 – genotipo eterozigote – sono presenti tutti i frammenti – H; 12 – controllo negativo.

3) Chip di DNA Consentono di determinare simultaneamente un numero molto elevato di polimorfismi in un campione. Un gran numero di sonde oligonucleotidiche sono posizionate sotto forma di punti individuali su un chip solido molto piccolo, ciascuna delle quali fornisce un'ibridazione specifica con alleli normali e mutanti di molti geni diversi. Prima dell'ibridazione, viene eseguita la marcatura fluorescente non specifica del DNA in studio. Se il DNA del campione si lega alla sonda sul chip, viene rilevato un segnale fluorescente dalla sezione corrispondente del chip [Ivanov, Tereshin, Shcherbak, 2010]. Sapere quale allele è responsabile della sintesi dell'uno o dell'altro isoenzima cito. P-450, è possibile determinare quali xenobiotici verranno biotrasformati e in che modo.

4) Programmi per computer per modellare l'interazione dei ligandi con i citocromi P 450 Per studiare l'interazione del substrato e dell'enzima, vengono utilizzati metodi di docking molecolare e di dinamica molecolare. Il docking molecolare (o docking molecolare) è un metodo di modellazione molecolare che consente di prevedere l'orientamento e la posizione di una molecola rispetto a un'altra che è più favorevole alla formazione di un complesso stabile. Utilizzando le funzioni di scoring si determinano le conformazioni energeticamente più favorevoli del ligando nel centro attivo. La dinamica molecolare è un metodo in cui l'evoluzione temporale di un sistema di atomi o particelle interagenti viene tracciata integrando le loro equazioni del moto. Svolge un ruolo importante (insieme alla cristallografia e all'NMR) nel determinare la struttura di una proteina e nel chiarirne le proprietà. I pacchetti software più diffusi per la modellazione della dinamica delle molecole biologiche sono: AMBER, CHARMM (e la versione commerciale CHARMMm), GROMACS, GROMOS, Lammhs, HOOMD-blue, NAMD.

Nel descrivere l'interazione cit. P-450 e ligandi, viene valutato il ruolo dei fattori spaziali ed energetici, poiché il contributo di questi fattori per vari cit. La R 450 è diversa. Per una descrizione completa dell'interazione tra il ligando a basso peso molecolare e il cit. P-450 in silico e le previsioni di possibili biotrasformazioni devono tenere conto: § della reattività dell'enzima, § della struttura del centro attivo dell'enzima, § della localizzazione e conformazione del ligando nel centro attivo dell'enzima, § la possibilità di molteplici modi di legarsi al substrato nel centro attivo dell'enzima (il legame può avvenire indirettamente attraverso le molecole dell'acqua), § reattività regiospecifica insita nel substrato stesso (può variare a seconda della conformazione adottata dal substrato), § la affinità del prodotto che deve essere rilasciato dal sito attivo dell’enzima.

R-zione ha chiamato regiospecifico, se come unità. prodotto (entro i limiti di errore) si forma uno dei due o più possibili regio-isomeri. I regioisomeri sono isomeri formati come risultato della trasformazione di uno dei numerosi possibili centri di reazione presenti nella molecola del substrato. Se nei prodotti di una soluzione prevale solo un isomero, si parla di tale soluzione. regioselettivo. Per esempio. , l'addizione di HBr elettrofilo asimmetrico allo stirene asimmetrico C 6 H 5 CH=CH 2 avviene in modo regiospecifico: si forma solo uno dei due possibili prodotti di addizione: C 6 H 5 CHBr. CH 3, ma non C 6 H 5 CH 2 Br.

Modelli QSAR. Le relazioni quantitative struttura-attività (QSAR - abbreviazione inglese di Quantitative Structure-Activity Relationships) consentono di prevederne le proprietà descrivendo la struttura dei composti chimici, inclusa la definizione dell'interazione con i citocromi dei composti a basso peso molecolare e la loro biotrasformazione. Ad esempio: 1) per classificare i substrati dei vari citocromi si utilizza: il metodo della support vector machine, il metodo dei K-nearest neighbors, il metodo dell'albero decisionale, ecc. 2) per valutare l'interazione dei ligandi (substrati e inibitori ) con il centro attivo del citocromo, vengono utilizzati i metodi QSAR tridimensionale (3 -D QSAR).

Superfamiglia cit. Il P-450 catalizza un gran numero di reazioni che avvengono attraverso meccanismi diversi, pertanto i metodi QSAR classici non possono essere applicati correttamente per sostanze appartenenti a classi diverse. Per ogni singolo citocromo che metabolizza uno xenobiotico, è necessario costruire uno speciale modello QSAR utilizzando diversi descrittori e diversi metodi matematici.

I principali citocromi P 450, responsabili del metabolismo dei farmaci nel corpo umano, studiati in silico, costituiscono la sottofamiglia dei citocromi. P-450 3 A. Il citocromo P 450 3A 4 è una proteina legata alla membrana situata nel reticolo endoplasmatico. Peso molecolare 57299 D, la struttura primaria contiene 502 residui aminoacidici. Il gene CYP 3 A 4 è localizzato sul braccio lungo del settimo cromosoma (7 q 22. 1). La sottofamiglia ZA è quella maggiormente espressa nel fegato e nell'intestino. Appartengono a questa sottofamiglia circa i 2/3 dei citocromi epatici. Due cit. R 450 ZA 4 e 3 A 5 sono descritti in dettaglio in letteratura. Citazione P 450 ZA 5 è più comune negli adolescenti, espresso polimorficamente e non indotto dai glucocorticoidi, in contrasto con ZA 4. Esiste un'altra isoforma espressa embrionalmente - ZA 7 (rappresenta il 50% dei citocromi fetali P 450).

Il citocromo b 5 è un'emoproteina che partecipa a una varietà di reazioni redox biochimiche come trasportatore di elettroni. La molecola microsomiale del citocromo b 5 è costituita da due domini: idrofilo e idrofobo. La regione idrofila N-terminale si trova sulla superficie della membrana del RE, è formata dai residui aminoacidici da 1 a 88 e contiene l'eme, che fa parte del centro attivo. Rappresentazione schematica della posizione della molecola del citocromo b 5 nella membrana.

Il dominio idrofobico del citocromo b 5 è ancorato nel doppio strato lipidico (ER o mitocondriale), spiralizzato, formato da residui aminoacidici all'estremità C-terminale della molecola proteica (residui aminoacidici 89-133). Utilizzando la modellazione computerizzata, è stato dimostrato che la regione C-terminale della molecola del citocromo b 5 forma un anello e penetra attraverso la membrana lipidica. La massima idrofobicità si osserva nella parte centrale dell'ansa, che è immersa nella membrana. La parte C-terminale della molecola enzimatica svolge un ruolo importante nell'inserimento nella membrana, nell'orientamento dell'enzima nel doppio strato lipidico e nel garantire l'attività funzionale.

Il citocromo b 5 della membrana esterna dei mitocondri, rispetto al microsomiale, ha un potenziale redox inferiore, la molecola è più resistente alla denaturazione chimica e termica, il legame tra apoproteina ed eme è molto più forte. Sono state identificate due regioni idrofobiche nella molecola mitocondriale del citocromo b 5. Il primo è formato dai residui di alanina-18, isoleucina-32, leucina-36 e leucina-47. Il secondo è isoleucina 25, fenilalanina-58, leucina-71 ed eme. Utilizzando forme mutanti della molecola, è stato dimostrato che entrambe le regioni idrofobiche sono di grande importanza nel mantenimento della stabilità della molecola. In assenza o sostituzione di residui di aminoacidi in essi, l'interazione dell'apoproteina con l'eme è ridotta.

Il ruolo del citocromo b 5 nelle reazioni catalizzate dalle isoforme del sistema del citocromo P-450. Possibili meccanismi di stimolazione dell'influenza cit. b 5 per le isoforme cit. P-450: trasferimento elettronico diretto in una reazione di monoossigenasi, senza la mediazione della NADP citocromo P-450 reduttasi; nel caso dell'utilizzo del secondo elettrone del citocromo b 5 nel ciclo della monoossigenasi, si verifica la formazione di radicali dell'ossigeno più attivi, che a loro volta sono accompagnati da una formazione più rapida del metabolita;

cit. b 5 interagisce con cit. P-450 con la formazione di un complesso di due emoproteine e il successivo trasferimento di due elettroni dal NADPH alla citocromo P-450 reduttasi. Ciò aumenta il tasso di formazione di ossigeno attivo ed elimina la necessità di ripetute interazioni cyt. P-450 e NADPH citocromo P-450 reduttasi; cit. b 5 può effettuare la stimolazione allosterica del cit. P-450 senza trasferimento di elettroni, ad esempio nella seconda fase del ciclo catalitico; il citocromo b 5 può avere un effetto protettivo sulle molecole terminali dell'ossigenasi, che non è associato alle reazioni del ciclo redox, che ne impedisce la distruzione.

Impatto cit. b 5 per modificare la velocità di reazione, lo spettro dei metaboliti e la formazione di specie reattive dell'ossigeno nelle reazioni del sistema cit. R-450. alla presenza del cit. b 5 il tasso metabolico della maggior parte dei composti endogeni e degli xenobiotici aumenta molto spesso; influenza cit. b 5 sulla biotrasformazione dello stesso composto, ad esempio l'androstenedione, varia nelle diverse specie animali. Nei conigli, in presenza di cit b 5, la velocità del metabolismo dello steroide cit. P-450 2 B 5 aumenta, e nei cani - cit. R-450 2 V 11 ridotto;

cit. b 5 in diverse specie (uomo e criceto) potrebbe non modificare la velocità di ossidazione del composto (nitrosammina) o avere un effetto stimolante; presenza di cit. b 5 cambia lo spettro dei metaboliti formati durante la biotrasformazione di un composto dalla stessa isoforma cit. P-450, ad esempio tetraclorobifenil cit. R-450 2V1; alla presenza del cit. b 5 si riduce la formazione di specie reattive dell’ossigeno, la cui sovrapproduzione influisce negativamente sull’attività vitale delle cellule dell’organismo; il metabolismo dei composti biologicamente attivi (acido arachidonico, leucotrieni) avviene solo in presenza di cit. b5.

L'influenza del citocromo b 5 sui cambiamenti nella velocità di reazione, sullo spettro dei metaboliti e sulla formazione di specie reattive dell'ossigeno nelle reazioni che coinvolgono varie isoforme del citocromo. P-450 (frammento) Isoforma del citocromo P-450 Substrato Variazione della velocità di reazione P-450 1 A 1 tetraclorobifenile P P-450 2 A 1 P-450 2 B 1 Androstenedione P - II - P P-450 2 B 2 2 -cloro -1, 1 difluoroetina tetraclorobifenile (2, 2", 5, 5" - e 2, 3", 4", 5 -) tetraclorobifenile (2, 3, 4, 4 -) 9 - antraldeide R-450 2 B 4 Tetranitrometano N - II - Aminopirina P Androstenedione P Il testosterone non cambia Formazione di specie reattive dell'ossigeno ↓ metanolo, 7-etossicumarina 9 - antraldeide Modifica dello spettro dei metaboliti P-450 1 A 2 - II - P-450 2 B 5 - II - ↓ P P cambia ↓ cambia P cambia

La NADH citocromo b 5 reduttasi è una flavoproteina. Questa è una proteina a due domini, il dominio citosolico globulare lega il FAD, il dominio idrofobico (singola “coda”) ancora la proteina nella membrana.

Citocromi P450. Struttura e funzione

Tra gli enzimi di fase 1, il posto principale è occupato dal sistema del citocromo P450 (P450 o CYP) in termini di attività catalitica verso un numero enorme di xenobiotici. La più alta concentrazione di citocromo P450 si trova nel reticolo endoplasmatico degli epatociti (microsomi). I citocromi microsomiali epatici P450 svolgono un ruolo critico nel determinare l'intensità e il tempo di azione dei composti estranei e un ruolo chiave nella disintossicazione degli xenobiotici, nonché nella loro attivazione di metaboliti tossici e/o cancerogeni. Le monoossigenasi dipendenti dal citocromo P450 sono un sistema di trasporto degli elettroni multienzimatico. Tutti i citocromi P450 sono proteine contenenti eme. Il ferro eme è solitamente in uno stato ossidato (Fe3+). Ridotto allo stato Fe2+, il citocromo P450 è in grado di legare ligandi come l'ossigeno o il monossido di carbonio. Il complesso del citocromo P450 ridotto con CO ha un massimo di assorbimento a 450 nm, che è stato la base per

nomi di questi enzimi. La reazione principale catalizzata dal citocromo P450 è una reazione della monoossigenasi, in cui un atomo di ossigeno interagisce con il substrato (RH) e l'altro viene ridotto ad H2O. Il NADPH partecipa come agente riducente alla reazione:

RH (substrato) + O2 + NADPH + H+ --> ROH (prodotto) + H2O + NADP+

Il meccanismo mediante il quale il citocromo riceve un elettrone dal NADPH dipende dalla localizzazione intracellulare del citocromo P450. Nel RE, dove si trova la maggior parte delle emoproteine coinvolte nella biotrasformazione degli xenobiotici, l'elettrone viene trasferito attraverso una flavoproteina chiamata NADPH-P450 reduttasi. Una molecola di reduttasi può fornire elettroni a diverse molecole P450. Nei mitocondri, dove si trovano gli itocromi P450 coinvolti nella biosintesi degli ormoni steroidei e nel metabolismo della vitamina D, l'elettrone viene trasferito utilizzando 2 proteine: ferrodossina o ferrodossina reduttasi.

Nella fig. La Figura 1 mostra il ciclo catalitico del citocromo P450. La prima parte del ciclo comporta l'attivazione dell'ossigeno, la seconda l'ossidazione del substrato. Il meccanismo d'azione del sistema della monoossigenasi microsomiale è stato descritto per la prima volta da Estabrook et al. ed è stato ora confermato da molti ricercatori. Questo schema è il seguente: la prima fase consiste nell'interazione del substrato con la forma ossidata di P450. Quando P450 si lega ai substrati

C'è una transizione del ferro eme da uno stato a basso spin a uno ad alto spin. La seconda fase consiste nella riduzione del complesso enzima-substrato risultante con il primo elettrone, che proviene dalla catena di trasferimento specifica del NADPH dal NADPH attraverso

flavoproteina I (NADPH-citocromo P450 reduttasi). La terza fase consiste nella formazione di un complesso ternario: citocromo P450 ridotto-substrato-ossigeno. Quarta fase

rappresenta la riduzione di un complesso ternario da parte di un secondo elettrone, che, come

si ritiene provenga dalla catena di trasporto degli elettroni specifica per NADH, costituita da NADH-

citocromo b5 reduttasi o flavoproteina II e citocromo b5. Il quinto stadio consiste in diversi processi, tra cui le trasformazioni intramolecolari del complesso ternario ridotto e la sua decomposizione con formazione di un prodotto idrossilato e acqua. In questa fase, il citocromo P450 si trasforma nella sua forma ossidata originale.

I citocromi P450 catalizzano i seguenti tipi di reazioni: idrossilazione di un atomo di carbonio alifatico o aromatico; epossidazione del doppio legame;

ossidazione dell'atomo (S, N, I) o N-idrossilazione; trasferimento del gruppo ossidato;

distruzione della comunicazione eterica; deidrogenazione. Alcune reazioni catalizzate

citocromo P450 sono mostrati in Fig. 2 e 3. Diverse classi di reagenti sono buone

L'ultimo carbonio della catena viene idrossilato, la cosiddetta omega-idrossilazione. COSÌ

l'idrossilazione interna avviene in diverse posizioni (posizioni -1,- 2).

Ciò si traduce in molte varianti di prodotto diverse anche con un alcano semplice come l'esano. Si noti che anche gli idrocarburi ciclici subiscono idrossilazione. Nella reazione di idrossilazione si forma prima un emiacetale che viene poi convertito in un alcol e in un'aldeide. Quando gli alcheni vengono ossidati dal citocromo P450, si formano ossidi biatomici. Variano nella loro stabilità e possono essere altamente reattivi. Ad esempio, il cloruro di vinile viene convertito metabolicamente in un ossido, che poi si trasforma in cloroacetaldeide, un mutageno che agisce direttamente sul DNA. Questi studi hanno portato al divieto dell'uso del cloruro di vinile nei nebulizzatori. Il gruppo vinilico dello sterolo (vinilbenzene) è noto per le sue proprietà cancerogene, ma il corpo umano è in grado di neutralizzarlo convertendo l'ossido in un diolo utilizzando l'enzima epossiidrolasi. Ma l’epossiidrolasi non sempre aiuta. Ad esempio, il citocromo P450 sintetizza l'epossido di aflotossina B1 in vivo. Questo composto è un elettrofilo altamente reattivo, è instabile e forma rapidamente un addotto con il DNA. Inoltre, anche il diolo formato dall'epossido è instabile e altamente reattivo. Anche l'ossidazione dei composti aromatici con il citocromo P450 produce epossidi, ma si trasformano rapidamente in fenolo. Come risultato dell'idrossilazione del benzene, il fenolo risultante può essere nuovamente idrossilato, trasformandosi in catecolo o idrochinone. Si noti che il catecolo e l'idrochinone possono reagire con l'ossigeno, inibendo reazioni simili con i chinoni e i superossidi, che sono tossine. Un composto così noto come la 2,3,7,8-tetraclorodibenzenediossina (TCDD) non è suscettibile all'idrossilazione ed è stabile (l'emivita nel corpo umano è di un anno o più).