Genetisk materiale av bakterier. Mikrobiologi: forelesningsnotater (K

Denne boken er beregnet på studenter ved medisinske utdanningsinstitusjoner. Denne korte veiledningen hjelper deg med å forberede og bestå mikrobiologieksamenen din. Materialet presenteres i en veldig praktisk og minneverdig form og vil hjelpe studentene til å detaljbeherske de grunnleggende konseptene og konseptene i kurset på kort tid, samt å konkretisere og systematisere kunnskap.

* * *

Det gitte innledende fragmentet av boken Mikrobiologi: forelesningsnotater (K.V. Tkachenko) levert av vår bokpartner - selskapet liter.

FOREDRAG nr. 4. Genetikk av mikroorganismer. Bakteriofager

1. Organisering av arvestoffet til bakterier

Det arvelige apparatet til bakterier er representert av ett kromosom, som er et DNA-molekyl, det er spiralisert og foldet til en ring. Denne ringen er festet til den cytoplasmatiske membranen på ett punkt. Individuelle gener er lokalisert på det bakterielle kromosomet.

De funksjonelle enhetene til bakteriegenomet, i tillegg til kromosomale gener, er:

1) IS-sekvenser;

2) transposoner;

3) plasmider.

IS-sekvenser er korte fragmenter av DNA. De bærer ikke strukturelle (proteinkodende) gener, men inneholder bare gener som er ansvarlige for transposisjon (evnen til å bevege seg langs kromosomet og integreres i dets forskjellige seksjoner).

Transposoner er større DNA-molekyler. I tillegg til genene som er ansvarlige for transposisjon, inneholder de også et strukturelt gen. Transposoner er i stand til å bevege seg langs et kromosom. Deres posisjon påvirker genuttrykk. Transposoner kan eksistere utenfor kromosomet (autonomt), men er ikke i stand til autonom replikering.

Plasmider er ekstra ekstrakromosomalt genetisk materiale. Det er et sirkulært, dobbelttrådet DNA-molekyl, hvis gener koder for ytterligere egenskaper, noe som gir selektive fordeler til celler. Plasmider er i stand til autonom replikering, dvs. uavhengig av kromosomet eller under dets svake kontroll. På grunn av autonom replikasjon kan plasmider gi opphav til fenomenet amplifikasjon: det samme plasmidet kan være tilstede i flere kopier, og derved forsterke manifestasjonen av en gitt egenskap.

Avhengig av egenskapene til egenskapene som plasmider koder for, skilles de ut:

1) R-plasmider. Gi medikamentresistens; kan inneholde gener som er ansvarlige for syntesen av enzymer som ødelegger medisiner, kan endre membranpermeabilitet;

2) F-plasmider. De koder for sex i bakterier. Mannlige celler (F+) inneholder F-plasmidet, det gjør ikke kvinnelige celler (F-). Mannlige celler fungerer som en donor av genetisk materiale under konjugering, og kvinnelige celler fungerer som en mottaker. De har en annen elektrisk ladning på overflaten og tiltrekker seg derfor hverandre. Selve F-plasmidet går fra giveren hvis det er i en autonom tilstand i cellen.

F-plasmider er i stand til å integreres i cellekromosomet og forlate den integrerte tilstanden for en autonom tilstand. I dette tilfellet fanges kromosomale gener, som cellen kan donere under konjugering;

3) Col-plasmider. Koder for syntesen av bakteriociner. Dette er bakteriedrepende stoffer som virker på nært beslektede bakterier;

4) Tox-plasmider. Koder for produksjon av eksotoksiner;

5) biologisk nedbrytningsplasmider. Koder enzymer som bakterier kan bruke xenobiotika med.

Tap av et plasmid av en celle fører ikke til dens død. Den samme cellen kan inneholde forskjellige plasmider.

2. Variasjon i bakterier

Det er to typer variabilitet - fenotypisk og genotypisk.

Fenotypisk variasjon - modifikasjoner - påvirker ikke genotypen. Endringer påvirker flertallet av individene i en populasjon. De er ikke arvet og blekner over tid, det vil si at de går tilbake til den opprinnelige fenotypen.

Genotypisk variasjon påvirker genotypen. Den er basert på mutasjoner og rekombinasjoner.

Mutasjoner er en endring i genotypen som vedvarer over en rekke generasjoner og er ledsaget av en endring i fenotypen. Et trekk ved mutasjoner i bakterier er den relative enkle påvisningen.

Mutasjoner kjennetegnes ved lokalisering:

1) gen (punkt);

2) kromosomalt;

3) plasmid.

Etter opprinnelse kan mutasjoner være:

1) spontan (mutagen ukjent);

2) indusert (mutagen ukjent).

Rekombinasjon er utveksling av genetisk materiale mellom to individer med utseendet til rekombinante individer med en endret genotype.

Bakterier har flere rekombinasjonsmekanismer:

1) konjugasjon;

2) fusjon av protoplaster;

3) transformasjon;

4) transduksjon.

Konjugering er utveksling av genetisk informasjon gjennom direkte kontakt mellom giver og mottaker. Plasmider har den høyeste overføringsfrekvensen, og plasmider kan ha forskjellige verter. Etter dannelsen av en konjugasjonsbro mellom giveren og mottakeren, kommer en tråd av donor-DNA inn i mottakercellen gjennom den. Jo lengre denne kontakten er, jo mer av donor-DNA kan overføres til mottakeren.

Protoplastfusjon er en mekanisme for utveksling av genetisk informasjon under direkte kontakt med deler av den cytoplasmatiske membranen i bakterier som mangler en cellevegg.

Transformasjon er overføring av genetisk informasjon i form av isolerte DNA-fragmenter når mottakercellen befinner seg i et miljø som inneholder donor-DNA. Transduksjon krever en spesiell fysiologisk tilstand hos mottakercellen – kompetanse. Denne tilstanden er iboende i aktivt delende celler der prosessene med replikering av deres egne nukleinsyrer finner sted. I slike celler opererer en kompetansefaktor - dette er et protein som forårsaker en økning i permeabiliteten til celleveggen og cytoplasmatisk membran, slik at et DNA-fragment kan trenge inn i en slik celle.

Transduksjon er overføring av genetisk informasjon mellom bakterieceller ved bruk av tempererte transduserende fager. Transduserende fager kan overføre ett eller flere gener.

Transduksjon skjer:

1) spesifikt (det samme genet overføres alltid, den transduserende fagen er alltid lokalisert på samme sted);

2) uspesifikk (ulike gener overføres, lokaliseringen av den transduserende fagen er ikke konstant).

3. Bakteriofager

Fagvirioner består av et hode som inneholder den virale nukleinsyren og en hale.

Nukleokapsiden til faghodet har en kubisk type symmetri, og prosessen har en spiralformet type, det vil si at bakteriofager har en blandet type symmetri.

Fager kan eksistere i to former:

1) intracellulært (dette er en profag, rent DNA);

2) ekstracellulært (dette er et virion).

Fager, som andre virus, har antigene egenskaper og inneholder gruppespesifikke og typespesifikke antigener.

Det er to typer fag-celle-interaksjon:

1) lytisk (produktiv virusinfeksjon). Dette er en type interaksjon der virusreproduksjon skjer i en bakteriecelle. Hun dør i prosessen. Først adsorberes fager på celleveggen. Så kommer penetrasjonsfasen. På stedet for fagadsorpsjon virker lysozym, og på grunn av de kontraktile proteinene i haledelen injiseres fagnukleinsyren inn i cellen. Dette etterfølges av en mellomperiode, hvor syntesen av cellulære komponenter undertrykkes og den disjunktive modusen for fagreproduksjon skjer. I dette tilfellet syntetiseres fagnukleinsyren i nukleoidregionen, og deretter skjer proteinsyntese på ribosomene. Fager som har en lytisk type interaksjon kalles virulente.

I den siste perioden, som et resultat av selvmontering, blir proteiner foldet rundt nukleinsyren og nye fagpartikler dannes. De forlater cellen, bryter celleveggen, dvs. lysering av bakterien skjer;

2) lysogen. Dette er tempererte fager. Når en nukleinsyre trenger inn i en celle, integreres den i cellens genom, og langsiktig samliv mellom fagen og cellen observeres uten at den dør. Når ytre forhold endres, kan fagen forlate sin integrerte form og utvikle en produktiv virusinfeksjon.

Basert på spesifisitet skilles følgende ut:

1) polyvalente fager (lyse kulturer av en familie eller slekt av bakterier);

2) monovalent (lysér kulturer av bare én type bakterier);

3) typisk (bare i stand til å forårsake lyse av visse typer (varianter) av en bakteriekultur innenfor en bakterieart).

Fager kan brukes som diagnostiske legemidler for å bestemme slekten og arten av bakterier isolert under bakteriologisk forskning. Imidlertid brukes de oftere til behandling og forebygging av visse infeksjonssykdommer.

Moderne biologi og genetikk skylder sine enestående prestasjoner mikrobiologi, som ga dem mikroorganismer som eksperimentelle emner. Betydningen og relevansen av forskning innen genetikk til mikroorganismer ligger først og fremst i det faktum at de var de første til å lage metoder for å kontrollere arvelighet.

I 1865 oppdaget den tsjekkiske vitenskapsmannen Gregor Mendel eksistensen av gener som diskrete arveenheter. I 1928 var F. Griffiths den første som forvandlet ikke-virulente pneumokokker til virulente. Han infiserte hvite mus med en blanding av bakterier bestående av varmedrepte kapselpneumokokker, som derfor mistet sin virulens, og levende akapsulære, ikke-virulente pneumokokker. I kontrolleksperimenter drepte ikke disse bakteriegruppene, introdusert separat, musene. I den eksperimentelle gruppen døde imidlertid musene og levende pneumokokker ble isolert fra blodet deres, etter å ha skaffet seg kapselen til drepte pneumokokker. Følgelig inneholdt drepte kapselpneumokokker et stoff som var i stand til å overføre tegn på kapseldannelse (virulens) til levende pneumokokker. Mekanismen for transformasjon forble ukjent.

I 1953 bestemte F. Crick og D. Watson genstrukturen basert på den doble helixen av DNA. Denne oppdagelsen viste hvordan genet utfører sine tre viktigste funksjoner:

• 1) kontinuitet i arv - semi-konservativ mekanisme for DNA-replikasjon;
• 2) kontroll av kroppens strukturer og funksjoner - ved hjelp av en genetisk kode som bruker en reserve på bare fire baser (bokstaver) - adenin (A), tymin (T), guanin (G), cytosin (C);
• 3) utviklingen av organismer på grunn av mutasjoner og genetiske rekombinasjoner.

Gjennom verkene til F. Crick, S. Brenner, M. Nirenberg, S. Ochoa, X. Korana, ved bruk av mikrobielle objekter, ble den genetiske koden dechiffrert i 1966, dens trefoldighet, ikke-overlappende og universalitet for alle levende organismer ble vist .

Forskere satte pris på det enkle å jobbe med bakterier og virus på grunn av deres egenskaper: kort generasjonsperiode, rask akkumulering av populasjoner med et stort antall individer, enkel dyrking og bruk. I bakterieobjekter ble messenger-, ribosomale og overførings-RNA-er oppdaget og mekanismen for proteinsyntese ble etablert. D. Lederberg og E. Tatum oppdaget konjugering i bakterier, V. Hayes oppdaget et plasmid som bestemmer den seksuelle polariteten til bakterier. F. Jacob og E. Wolman skapte teorien om plasmider. Konseptet med operon, utviklet på Escherichia coli-modellen av F. Jacob og J. Monod, har blitt et universelt konsept for genetisk kontroll av genuttrykk.

I 1972 oppsto genteknologi og er i rask utvikling. Av sentral betydning for dens forekomst og kontroll av arvelighet var oppdagelsen i 1970 av G. Temin, S. Mizutani, D. Baltimore av enzymet revers transkriptase (revertase, RNA-avhengig DNA-polymerase) i noen onkogene virus. Dette gjorde det mulig å få et kopi-DNA-gen på en messenger-RNA-matrise og bruke det i genteknologi. Bioteknologi basert på genteknologi bruker mye bakterielle enzymer, plasmid- og virale vektorer, samt bakterier som hovedprodusenter av biologiske produkter.

Prokaryoter (bakterier) har morfologisk distinkte cellulære strukturer som inneholder genetisk informasjon - nukleoider. Nukleoidet består av ett kveilet kromosom, som er fritt plassert i cytoplasmaet, men er assosiert med visse reseptorer på den cytoplasmatiske membranen. Derfor er en bakteriecelle, i motsetning til eukaryoter, haploid, dvs. inneholder ett sett med gener.

Under noen forhold kan bakterieceller inneholde kopier av et kromosom som er helt identiske i sitt sett med gener, og bakteriene forblir haploide. I motsetning til alle andre organismer, har bakterier den unike egenskapen til å endre massen av deres DNA, regulere innholdet av kopier av genene deres avhengig av levekår, tilsvarende massen av 2, 4, 6, 8 kromosomer. Dette lar dem regulere hastigheten på sin egen reproduksjon - en av hovedbetingelsene som sikrer overlevelse av bakterier i miljøet, og derfor bevaring av arten i naturen.

Det bakterielle kromosomet er et dobbelttrådet DNA-molekyl (sirkulært kromosom) som inneholder gener ordnet i en lineær rekkefølge. Siden lengden på kromosomet (y E coli ca. 1000 µm) er mange ganger lengre enn lengden på en bakterie (1,5-3,0 µm i gjennomsnitt), er kromosomet kompakt pakket i en supercoil form i form av 12-80 løkker assosiert med en kjernestruktur representert av en spesiell klasse av RNA - 4,5 S RNA. Genomet (hele settet av nukleotider inneholdt i kromosomet til et gitt individ) og genotypen (hele settet med individuelle gener i et gitt individ) i bakterier er ikke entydige, men er nære, siden de fleste gener er inneholdt i kromosomet i entall, i motsetning til eukaryoter som inneholder opptil 30-50 % av gjentatte nukleotidsekvenser i genomet. Derfor uttrykkes størrelsen på genomer i bakterier, virus og plasmider enten i molekylvekt, eller i antall nukleotidpar av den genomiske nukleinsyren, eller i antall gener. Disse verdiene er sammenlignbare, siden hvert gen i gjennomsnitt består av 1000 nukleotidpar, og massen til ett DNA-nukleotid er 500 dalton. Ja, kromosom E coli har en molekylvekt på 2,8 x 10 9 dalton, antall nukleotidpar er 3,8 x 10 6 og inneholder 2500-3000 gener.

Det bakterielle kromosomet består av to typer gener: strukturelle (cistroner), som koder for syntesen av en spesifikk polypeptidkjede, og regulatorisk (eller akseptor), som regulerer aktiviteten til gener (regulatorer, operatører, promotere, attenuatorer, terminatorer, etc.) . Den viktigste strukturelle og funksjonelle enheten til et kromosom er operonet. Dette er en gruppe strukturelle cistrongener som er fysisk knyttet til hverandre og til operatorgenet som kontrollerer deres uttrykk. På sin side er en operon eller en gruppe av dem under kontroll av en genregulator, som representerer en mer kompleks strukturell og funksjonell enhet - et regulon.

Gener på et kromosom er ordnet lineært, slik at du kan studere sekvensen deres og tegne et kromosomalt (genetisk) kart. For å gjøre dette studeres tidspunktet for overføring av de tilsvarende genene under bakteriell konjugering. Lokaliseringen av gener på kromosomet bestemmes i løpet av minutter etter overføringen, spesielt for Escherichia coli - fra 0 til 100 minutter.

For tiden er hovedmetoden for å studere organiseringen av genomer til levende organismer sekvensering - å bestemme sekvensen av nukleotider i DNAet til gener. Først ved bruk av kloningsteknikken oppnås et stort antall nødvendige DNA-fragmenter. Nukleotidsekvensen til DNA-kromosomene til 20 viktigste bakterier er allerede fullt ut studert (K skadedyr er E. coli, P. aeruginosa og så videre.).

Noen gener og gengrupper av bakterielle kromosomer og bakterieplasmider tilhører transponerbare genetiske elementer, dvs. genetiske strukturer som er i stand til å bevege seg i en intakt form innenfor et gitt genom eller flytte fra ett genom til et annet, for eksempel fra plasmid til bakteriell og vice versa. Transponerbare genetiske elementer er representert av IS-elementer og transposoner. IS-elementer, eller innsettingssekvenser, er vanligvis små i størrelse, og overstiger ikke to tusen basepar. De bærer bare ett gen som koder for en proteintransposase, ved hjelp av hvilke IS-elementer integreres i ulike deler av kromosomet. De er betegnet: IS 1, IS2, IS3, etc. Transposoner (Tp) er større segmenter av DNA flankert av inverterte IS-elementer. I tillegg til genene som muliggjør transponering, inneholder de forskjellige andre gener. Innenfor en stor transposon kan det være mindre transposoner.

Transposoner er i stand til å sette inn i forskjellige deler av et kromosom eller flytte fra ett genom til et annet. Svært ofte er transposoner inneholdt i R-plasmider. Transposoner er funnet i genomene til bakterier, plasmider, virus og eukaryoter. De spiller en viktig rolle i variasjonen og utviklingen av levende materie. Transposoner er angitt med serienummer: Tn1, Tn2, Tn3, etc.

Alle kjente plasmider er små, kovalent lukket i en ring, superkveilede dobbelttrådete DNA-molekyler, hvis størrelse varierer fra 1,5 til 200 MD (fra 1500 til 400 000 nukleotidpar). Jo større molekylvekt, jo mer komplekst er settet av gener og jo mer mangfoldige funksjoner har plasmidene. Plasmider inneholder selvreplikasjonsgener; gener som kontrollerer selvoverføring eller mobilisering for overføring; andre gener som bestemmer de spesifikke funksjonene til selve plasmidet. For eksempel bestemmer F-plasmider donorfunksjonene til cellen og dens evne til å konjugere; Ent-plasmider - syntese av enterotoksiner; biologisk nedbrytende plasmider - ødeleggelse av ulike organiske og uorganiske forbindelser.

Plasmider er preget av følgende egenskaper:

• selvregulert replikering;
• fenomenet overflateekskludering (en mekanisme som ikke lar et annet, relatert plasmid komme inn i en celle som allerede inneholder et plasmid);
• fenomenet inkompatibilitet (to nært beslektede plasmider kan ikke sameksistere stabilt i en celle, en av dem fjernes);
• kontroll av antall plasmidkopier per cellekromosom (det er lavkopi - 1-4 kopier og høykopi - fra 12 til 38 kopier av plasmidet);
• kontroll av stabil bevaring av plasmider i vertscellen;
• kontroll av jevn fordeling av datterplasmider inn i datterbakterieceller;
• evne til selvoverføring (i konjugative plasmider);
• evne til å bli mobilisert for overføring (i ikke-konjugative plasmider);
• evnen til å gi vertscellen ytterligere viktige biologiske egenskaper som fremmer overlevelsen av bakterier og plasmider i naturen.

Plasmider spres blant bakterier på to måter: vertikalt - ved overføring fra foreldrecellen til datterceller under prosessen med bakteriell celledeling; horisontalt - ved overføring mellom celler i en bakteriepopulasjon uavhengig av celledeling. Overføringen av plasmider mellom bakterieceller utføres av mekanismen for selvoverføring ved konjugering kontrollert av tra-operonet til plasmidet. Avhengig av tilstedeværelsen av dette operonet, deles plasmider inn i konjugative og ikke-konjugative. Andre mekanismer for plasmidoverføring er også mulig (mobilisering for overføring av ikke-konjugative plasmider ved bruk av konjugative plasmider, transformasjon, transduksjon).

Klassifiseringen av plasmider er basert på deres unike egenskap av inkompatibilitet, dvs. manglende evne til beslektede plasmider til å sameksistere stabilt i samme celle. Det manifesterer seg etter at plasmidet trenger inn i en celle som allerede inneholder et nært beslektet plasmid. Plasmider som er inkompatible med hverandre, men kompatible med andre, kombineres til én Inc-gruppe. For eksempel ble 39 Inc-gruppe plasmider funnet i enterobakterier. Plasmider som tilhører samme Inc-gruppe har mange felles egenskaper.

Plasmider har viktig medisinsk betydning, siden de kontrollerer syntesen av ulike patogenisitetsfaktorer til bakterier og deres medikamentresistens. Den generelle biologiske betydningen av plasmider er at de er et unikt middel for bakteriell selvforsvar og favoriserer bevaring av bakterier i naturen.

Overføringen av genetisk informasjon til avkom (vegetativ DNA-replikasjon) skjer i bakterier og plasmider i henhold til en universell mekanisme - semi-konservativ DNA-replikasjon. I dette tilfellet mottar datterceller kromosom-DNA, der den ene tråden er foreldre (konservativ), den andre DNA-strengen er nylig syntetisert på sin matrise, noe som sikrer svært nøyaktig overføring av genetisk informasjon (arvelighet). Vegetativ DNA-replikasjon i bakterier begynner fra et strengt fiksert kromosomalt sted (oriC), som gjenkjennes av replikasjonsinitierende enzymer. Den er semi-konservativ i naturen, går samtidig i to retninger, og ender på et strengt fast punkt - terminus. Siden DNA-kjedene er antiparallelle (hvis en tråd starter fra 5. ende, den andre fra 3. ende), og DNA-polymerase III utfører DNA-syntese kun i 5-3-retningen, skjer replikasjonen forskjellig på hver tråd: på en av de ikke-vridde trådene ("straight", "leader") går det kontinuerlig, og på den andre ("lagging") DNA-polymerase III må tilbake for å vokse tråden også i 5-3-retningen, intermitterende, gjennom dannelsen av Okazaki-segmenter med en lengde på ca. 1000 i bakterienukleotider.

Hastigheten for DNA-replikasjon i E. coli ved 37 °C tilsvarer inkorporering av 2 x 10 3 nukleotidpar per sekund. DNA-replikasjon involverer et kompleks av enzymer som danner en enkelt struktur - replisomet. Genetisk kontroll av DNA-replikasjon utøves av en stor gruppe kromosomale gener.

I tillegg til den vegetative typen, har bakterier konjugative og reparerende typer DNA-replikasjon. Konjugativ replikasjon skjer under den konjugative metoden for utveksling av genetisk materiale og kontrolleres av plasmidgener (tra-operon). I dette tilfellet fullføres den andre DNA-strengen, den komplementære strengen overføres fra giveren til mottakeren. Reparativ replikasjon fungerer som en mekanisme for å eliminere strukturell skade fra DNA eller forekommer i sluttfasen av genetisk rekombinasjon. Det kontrolleres av kromosomale gener og plasmidgener.

Informasjonen i bakteriegenomet blir dechiffrert, materialisert og implementert gjennom proteinbiosyntese. Universaliteten til den genetiske koden tilsvarer universaliteten til dens dekoding og implementering (uttrykk). Imidlertid har proteinbiosyntese i bakterier noen funksjoner på transkripsjonsstadiet. Genene til bakterier, i motsetning til genene til eukaryoter og virus, inneholder ikke nitroner, så bakterier har ikke en spleiseprosess under syntesen av mRNA. RNA-spleising er en prosess der introner (ikke-kodende sekvenser i gener med en intron-ekson-struktur) blir skåret ut fra primære RNA-transkripter og eksoner kobles sammen, noe som resulterer i dannelse og deretter translasjon av modent mRNA. Mangelen på RNA-spleising i bakterier er en naturlig genetisk barriere i implementeringen av eukaryotisk genetisk informasjon i bakterier (prokaryoter). Å overvinne denne barrieren førte til etableringen av genteknologi på bakterieobjekter.

Genetisk informasjon realiseres av mikroorganismer veldig "økonomisk", i samsvar med de spesifikke betingelsene for deres eksistens. Bare gener som er nødvendige for å sikre cellelevedyktighet under gitte forhold "fungerer" (uttrykkes). Selvregulering av det genetiske informasjonssystemet sikres ved tilstedeværelsen i det, i tillegg til strukturelle gener som koder for proteiner og andre makromolekyler, av spesielle nukleotidsekvenser (akseptor- eller regulatoriske gener) som ikke har kodende funksjoner, men kontrollerer driften av strukturelle gener. Som allerede nevnt, utgjør et sett med strukturelle og regulatoriske gener lokalisert i nærheten et operon, enheten for genetisk regulering. Den klassiske modellen av et operon er laktoseoperonet. La oss vurdere, ved å bruke eksempelet på laktoseoperonet til Escherichia coli, dets struktur og metode for å regulere aktiviteten til strukturelle gener som koder for syntesen av enzymer involvert i absorpsjonen av laktose.

Operonet begynner med "festestedet for aktivatorproteinet" - produktet av oppstrøms regulon (Cap-protein, uten hvilket RNA-polymerase ikke kan kontakte operonet og begynne transkripsjon). Neste på kromosomet er en promoter - et sted for gjenkjennelse av RNA-polymerase og dets vedlegg. Så kommer operatøren – stedet som et spesielt transkripsjonshemmende regulatorisk protein binder seg til. Etter operatøren er de strukturelle genene z, y og a lokalisert sekvensielt, og koder for henholdsvis syntesen av tre enzymer som er involvert i fordøyelsen av laktose - R-galaktosidase, galaktosidpermease, tiogalaktosidtransacetylase. Lac-operonet ender med en terminator - en liten del av DNA som fungerer som et stoppsignal som stopper progresjonen av RNA-polymerase og transkripsjon av operonet. Utenfor 1ac-operonet, et annet sted på kromosomet, er det et spesielt regulatorgen som koder for den kontinuerlige syntesen av en proteinregulator. Når det ikke er laktose i miljøet, fester det regulatoriske proteinet seg til operonet og forhindrer, som en "barriere", bevegelsen av RNA-polymerase fra promoteren til de strukturelle genene, og undertrykker transkripsjon og, til slutt, syntesen av enzymer. Laktose, hvis tilstede i næringsmediet, binder seg til regulatorproteinet og endrer allosterisk konfigurasjonen, som et resultat av at regulatorproteinet ikke lenger kan feste seg til operatøren. Som et resultat blir "barrieren" åpnet, RNA-polymerase transkriberer strukturelle gener til det tilsvarende mRNA, på matrisen som enzymer som fordøyer laktose syntetiseres.

Således induserer laktose syntesen av enzymer som er nødvendige for absorpsjon. Slike enzymer kalles adaptive eller induktive. Typen regulering av genaktivitet som vurderes kalles negativ, siden den er basert på undertrykkelse av operonet av et regulatorisk protein. Det er to varianter av denne typen regulering: negativ induksjon, som vi så på, og negativ undertrykkelse.

I sistnevnte tilfelle, i utgangsposisjonen, kan det regulatoriske proteinet ikke binde seg til operatøren, og enzymsyntese oppstår, og i nærvær av en effektor, vanligvis sluttproduktet av virkningen av anabole enzymer, det regulatoriske proteinet, under dets påvirkning , binder seg til operatøren og enzymsyntese undertrykkes. I tillegg til det negative er det også kjent en positiv type genetisk regulering av proteinsyntese. Forskjellen fra den negative typen er at proteinproduktet til det regulatoriske genet ikke forbyr transkripsjon av operonet, men tvert imot aktiverer det. Denne typen regulering finnes også hos bakterier i to varianter – positiv induksjon og positiv undertrykkelse. For eksempel virker ara-operonet, som kontrollerer opptaket av arabinose, i Escherichia coli gjennom en positiv induksjonsmekanisme.

Manifestasjonen av egenskapene til levende organismer, kontrollert av genotypen, avhenger av organismens eksistensbetingelser. Settet med egenskaper til en organisme under de spesifikke forholdene for dens eksistens kalles en fenotype. Avhengig av forholdene kan mikroorganismer av samme genotype ha forskjellige fenotyper, siden forskjellige deler av den genetiske informasjonen til genotypen er implementert eller implementering skjer i et annet område av genotypereaksjonsnormen. Endringen av fenotyper når betingelsene for en organismes eksistens endres, kalles modifikasjon. Modifikasjoner er med andre ord fenotypiske forskjeller forårsaket av eksterne faktorer i arvelig identiske mikroorganismer.

De karakteristiske tegnene på modifikasjon i bakterier er (tre "Os"):

• sikkerhet for variabilitet (en bestemt miljøfaktor eller forhold forårsaker en endring i en strengt definert egenskap);
• fellesskap av endringer (endringer i en egenskap samtidig hos alle eller de fleste individer av en genetisk homogen populasjon);
• reversibilitet av endringer (endringer er ikke arvet, etter opphør av den eksterne faktoren forsvinner de).

I noen tilfeller observeres såkalte langsiktige modifikasjoner i bakterier, når en endring i en karakteristikk vedvarer i flere generasjoner etter opphør av virkningen av faktoren. Dette skyldes det faktum at under celledeling overføres ikke bare strukturene til genotypen, men også innholdet i cellen, som delvis beholder restene av stoffer dannet under tidligere forhold.

La oss vurdere et eksempel på modifikasjonsvariabilitet av bakterier. Ved såing av en fortynnet bakteriekultur Proteus vulgaris Bakteriekolonier vokste på næringsagaren innen 24 timer, som hver var omgitt av en svermingssone. Etter å ha sådd koloniene på nytt på næringsagar med galle, vokste alle koloniene i løpet av 24 timer uten å sverme. Etter å ha sådd disse koloniene på nytt på den opprinnelige næringsagaren, hadde alle oppvokste kolonier igjen svermesoner.

Endringer i fenotypen til Proteus på et medium med galle bør betraktes som en modifikasjon, siden alle tre karakteristiske trekk er tilstede: sikkerhet for variabilitet (forbindelsen mellom fravær av sverming og faktoren - galle), generell variasjon (endringer i alle kolonier av befolkningen), reversibilitet (i fravær av galle i næringsmediet, returnerer bakterier til den opprinnelige fenotypen).

Muligheten for bakteriell modifikasjon bør hele tiden tas i betraktning i det praktiske arbeidet til mikrobiologer. For nøyaktig taksonomi og identifikasjon av bakterier, må standard (enhetlige) betingelser for å studere egenskapene til bakterier (standard næringsmedier, tester, reagenser, temperatur og andre dyrkingsforhold) følges strengt.

Den primære kilden til nye gener i naturen er mutasjoner. Det er ingen generelt akseptert definisjon av en mutasjon. Mutasjon fra lat. mutatio er en endring i de genetiske strukturene som er tilstede i cellen i et gitt øyeblikk, som er stabilt arvet. Det er to grupper av mutasjoner: kromosomavvik, inkludert 3 typer (endringer i antall sett med kromosomer, endringer i antall individuelle kromosomer, kromosomomorganiseringer) og genmutasjoner. Bakterier kan ha mutasjoner som kromosomomorganiseringer og genmutasjoner. I dette tilfellet utføres kromosomomorganiseringer gjennom delinger (tap av et kromosomfragment), inversjon (rotasjon av et kromosomsnitt med 180°), transposisjoner (innsetting av små DNA-fragmenter på et sted på kromosomene, for eksempel innsettingssegmenter eller transposoner). Genmutasjoner kan være enkelt-sted (i en region av genet) eller multi-site. For at en mutasjon skal vises i et gen, er en enkeltpunktsendring i ett par nukleotider tilstrekkelig. Mutasjonsretningen kan være direkte eller omvendt. Direkte mutasjoner forårsaker endringer i egenskapene til en villtype organisme; reverse mutasjoner er ledsaget av reversjon til villtypen. Gjenoppretting av den opprinnelige fenotypen som følge av en omvendt mutasjon i en annen del av genet eller i et annet gen er en suppressormutasjon. En mutasjon som endrer to eller flere egenskaper ved en organisme kalles pleiotropisk. Det er også spontane og induserte mutasjoner. Spontane mutasjoner oppstår spontant i den forstand at de er bestemt, men vi kjenner ikke deres spesifikke årsaker. Induserte mutasjoner er forårsaket av eksponering for visse mutagene faktorer. Disse inkluderer ulike typer ioniserende stråling, ultrafiolette stråler og kjemiske mutagener.

Variabilitet i mutasjonsmekanismen er preget av visse særtrekk.

• 1. Arvelighet.
• 2. Lav frekvens (rate) av mutasjon (i bakterier 1 x 10 6 - 1 x 10 7, dvs. mutasjon i én celle av 1-10 millioner). Evnen til å produsere mutasjoner (mutabilitet) påvirkes av genotypen. Hos bakterier øker mutabiliteten kraftig hvis de har spesielle gener - mutatorer. For eksempel ble to mutatorgener funnet i Escherichia coli - mut T, mut SI.
• 3. Ikke-retningsmessig variasjon (dvs. usikkerhet, utilstrekkelighet av endringer i egenskaper på grunn av en påvirkningsfaktor; samme faktor forårsaker ulike mutasjoner).

Eksperimentene til S. Luria og M. Delbrück (fluktuasjonstest), Newcomb (omfordelingstest) viste eksistensen i de opprinnelige populasjonene av bakterier av spontane mutanter som er resistente mot den påvirkningsfaktoren - fagen - selv før dens innflytelse. Fingeravtrykksteknikken (replika) utviklet av D. Lederberg gjorde det mulig å isolere mutanter direkte fra en populasjon av celler før eksponering for en adekvat faktor eller etter eksponering for et mutagen - en rekke mutanter som ikke har tilstrekkelige egenskaper.

Bakterier har spesielle systemer for å reparere mutasjons-DNA-skader. De mest studerte systemene er: "fotoreaktivering", "mørk reparasjon", "replikativ reparasjon". "Fotoreaktivering" reparerer defekter (tymin-dimerer) i DNA som kun er forårsaket av ultrafiolette stråler. Under "mørk reparasjon" fungerer et kompleks av enzymer som gjenoppretter skade på en DNA-streng ved å kutte ut det skadede området og syntetisere i stedet en andre tråd av et komplementært DNA-segment som erstatter defekten. Det "replikative reparasjonssystemet" erstatter skade på begge DNA-trådene gjennom rekombinasjon.

En annen mekanisme for arvelig variasjon er utveksling av genetisk materiale mellom celler i bakteriepopulasjoner (horisontalt). Det skaper ikke nye elementære egenskaper, men det akselererer i stor grad dannelsen av organismer med nye kombinasjoner av egenskaper på grunn av omfordeling av gener fra forskjellige genomer, noe som bidrar til rask tilpasning av bakterier til miljøforhold. Bakterier er i stand til omfattende genetisk utveksling mellom ulike arter og slekter, så vel som med bakteriofager og plasmider. Hos bakterier er det identifisert tre hovedformer for utveksling av genetisk materiale: transformasjon, transduksjon, konjugering (fig. 3.2, 3.3). De er forskjellige i måten genetisk materiale overføres på.

Transformasjon er karakterisert ved overføring av noen donorgener til mottakercellen ved bruk av fritt DNA isolert fra giverens genom. Transformasjon kan være spontan eller indusert. Spontan transformasjon under naturlige forhold manifesterer seg i utseendet til rekombinanter når genetisk forskjellige celler blandes. Det oppstår på grunn av DNA frigjort av celler til miljøet under lyseringen eller som et resultat av aktiv DNA-frigjøring av levedyktige donorceller. Indusert (kunstig) transformasjon skjer når renset DNA hentet fra donorbakterier tilsettes bakteriekulturen. Vellykket transformasjon krever en rekke forhold knyttet til DNA og mottakerbakterier. DNAet må være dobbelttrådet, ha fragmenter på 3-5 x 10 6 dalton, og være delvis eller fullstendig homologt med mottakerens DNA. Mottakercellene skal ha kompetanse, d.v.s. mottakelighet, som bare oppstår i løpet av en viss periode av livssyklusen, skyldes frigjøring av en spesiell protein "kompetansefaktor" fra cellen og en spesifikk endring i permeabiliteten til celleveggen og membranen. Transformasjonsprosessen består av flere stadier: binding av DNA på overflaten til en kompetent mottaker til "kompetansefaktoren", penetrering av DNA ved å "trekke" inn i cellen, inkludering av DNA i kromosomet til mottakerbakterien ved rekombinasjon, ekspresjon av overførte gener. Effektiviteten til genetisk transformasjon øker mange ganger hvis blandingen av DNA og transformerte celler behandles med en elektrisk impuls (elektrotransformasjonsmetode). Under naturlige forhold er effektiviteten av transformasjon mindre betydelig enn andre former for overføring av genetisk materiale. Bakterieceller har en mekanisme for å beskytte genomet mot fremmed DNA - spesielle modifikasjons- og restriksjonssystemer. Disse systemene beskytter deres DNA ved modifikasjon (vanligvis ved metylering) og ødelegger fremmed DNA ved hjelp av spesielle enzymer - restriksjonsendonukleaser. Et spesielt transformasjonsalternativ er transfeksjon, når bakteriofag eller plasmid-DNA introduseres i en mottakercelle som mangler en cellevegg.

Transduksjon er overføring av genetisk materiale fra en donorcelle til en mottakercelle ved hjelp av bakteriofager. Det er generell (uspesifikk) og spesifikk transduksjon. Mekanismen for generell transduksjon er at under den intracellulære reproduksjonen av en virulent fag, kan et fragment av bakteriell DNA lik lengden på fagen ved et uhell inkluderes i hodet i stedet for fag-DNA. Slik oppstår defekte fager, som i stedet for sitt eget genomiske DNA inneholder et fragment av DNA fra donorbakterien. Slike fager beholder smittsomme egenskaper. De blir adsorbert på bakteriecellen og innfører DNA i den, men fagen formerer seg ikke. Ved genetisk rekombinasjon av et donor-DNA-fragment introdusert av en fag med kromosomet til mottakercellen, er den nye egenskapen arvelig fiksert. Under generell transduksjon er fagen derfor bare en passiv bærer av genetisk materiale.

Spesifikk transduksjon utmerker seg ved overføring av et strengt definert DNA-fragment av en donorbakterie av tempererte bakteriofager. Som kjent er tempererte bakteriofager de som kan integrere bakterieceller i kromosomet og forårsake lysogenisering. En temperert fag (profag) integrert i kromosomet til en donorbakterie, forlater under visse forhold kromosomet, "griper" de nærmeste DNA-delene av bakteriekromosomet og etterlater en del av genomet. En defekt temperert fag oppstår som inkorporerer bakteriegenene til donorbakterien i genomet. Deretter introduserer den transduserende fagen sitt DNA i cellen til mottakerbakterien, hvor den, sammen med et DNA-fragment av donorbakterien, integreres i mottakerkromosomet. Deretter kan fagen forlate mottakerens kromosom, men genene til donorbakterien som overføres av den, forblir i mottakeren. Et eksempel er den tempererte bakteriofagen lambda (X), som alltid bærer gal operon eller oneron bio. Spesifikk og generell transduksjon er lavfrekvent (10 -4 - 10 -7 per 1 fagpartikkel). En spesiell variant av spesifikk transduksjon er fag eller lysogen konvertering. Den transduserende fagen, integreres i mottakerkromosomet, forårsaker lysogenisering av bakterien og overfører gener for nye egenskaper, for eksempel toksindannelse, til difteribakterier. Imidlertid er genene som kontrollerer den nye egenskapen hele tiden inkludert i genomet til slike transduserende fager. Utseendet til disse genene er ikke assosiert med den foreløpige reproduksjonen av fagen på giftige givere. Fagen inkorporerte sannsynligvis disse genene i genomet på tidligere stadier av utviklingen. Slike transduserende fager er ikke-defekte og forårsaker fagomdannelse ved en meget høy frekvens.

Konjugering er preget av overføring av genetisk materiale gjennom direkte kontakt mellom celler. Denne prosessen er polar - genetisk materiale overføres kun fra donorbakterier til mottakerbakterier. Donorcellefunksjonen og konjugasjonsprosessen styres av konjugasjonsoverføringsgener (tra-operon), lokalisert i konjugative plasmider. Blant de mange konjugative plasmidene er det plasmid F, som kun kontrollerer disse funksjonene. I en autonom, ekstrakromosomal tilstand sikrer den donorcelletypen F+ (hann), dannelsen av hule villi (F-pili) og sin egen overføring til F- (kvinnelige) mottakerceller. I dette tilfellet overføres ikke donorkromosomet, og mottakere som mottok F-plasmidet får donortypen F+. Når plasmid F integreres i kromosomet til vertsbakterien, dannes Hfr (høy frekvens av rekombinasjon) - bakteriestammer med høy frekvens for overføring av kromosomale gener. Plasmid F passerer imidlertid vanligvis ikke inn i mottakercellen, siden det er lokalisert i enden av kromosomet motsatt av det som overgangen begynner fra.

Passasjen av et kromosom gjennom en konjugasjonsbro mellom celler gjennom F-pili-kanalen er assosiert med replikasjonen. I dette tilfellet passerer bare én DNA-streng av kromosomet gjennom broen, hvorpå en komplementær andre streng syntetiseres i mottakercellen, og deretter, under kontroll av rekombinasjonsgenene (rekombinasjonsgenene) til mottakerkromosomet, overført DNA-fragment integreres i mottakerkromosomet. Plasmid F kan gå tilbake i Hfr-stammer til den opprinnelige ekstrakromosomale tilstanden ved å fange opp en tilstøtende region av bakteriekromosomet. På denne måten dannes plasmid F' (F-prim) som bærer en del av vertsbakteriens kromosomale gener, for eksempel plasmid F' lac. Overføringen av donorgener til mottakerceller via F'-plasmider kalles sexduksjon. I dette tilfellet overfører plasmid F' genomet sitt, som også inneholder noen donorgener, med høy frekvens, men kromosomet til donorbakterien overføres ikke.

Overføring av andre typer konjugative plasmider (R, Ent, Col, etc.) skjer også med høy frekvens. Det skal bemerkes at effektiv overføring av plasmider ved konjugering ikke kjenner "relaterte" barrierer og forekommer mellom bakterier av forskjellige arter og slekter.

Ved enhver form for utveksling av genetisk materiale er det siste stadiet rekombinasjon mellom det resulterende DNA og kromosomet til mottakercellen. Når en DNA-streng overføres, kompletteres den først med en komplementær streng. Bare dobbelttrådet DNA rekombinerer med hverandre. Generell rekombinasjon, stedsspesifikk rekombinasjon og rekombinasjon kontrollert av transponerbare elementer er kjent.

Generell rekombinasjon skjer mellom homologe DNA-er. Stedspesifikk rekombinasjon skyldes tilstedeværelsen av spesifikke steder i de rekombinerende DNA-molekylene, for eksempel kromosomer E coli og den tempererte bakteriofagen lambda. Generelle og stedspesifikke rekombinasjoner styres av hea A-genet. Rekombinasjoner utført av transposerbare elementer er også stedsspesifikke og bestemmes av spesielle nukleotidsekvenser, men er ikke avhengige av hea A-genet. Den ledende rollen i rekombinasjonsprosesser i bakterier tilhører genet A. Produktet, Rec A-proteinet (molekylvekt 38 ​​kDa), har unike funksjoner: det binder seg fast til enkeltstrenger av DNA; fremmer frigjøringen av den ødelagte tråden fra DNA-dobbelthelixen; holder sammen den enkle DNA-strengen og den doble helixen av DNA; har egenskapen til en DNA-avhengig ATPase. Gene hes A er ikke bare involvert i prosessen med rekombinasjon. Produktet er nødvendig for postreplikativ reparasjon, profaginduksjon, celledeling og andre viktige funksjoner til bakterier. Recessive mutasjoner i et slikt gen påvirker alle disse funksjonene, så de kalles SOS-funksjoner, og deres helhet representerer et enkelt SOS-system. Ekspresjonen av enhver SOS-funksjon avhenger av aktiviteten til hec A-genproduktet. SOS-systemet utløses etter skadelige effekter på DNA. Derfor er hec A-genet av primær betydning i selvforsvaret av det genetiske systemet til bakterier.

Bruken av genetiske metoder for å studere bakteriegenomet gjorde det mulig å lage en genetisk taksonomi av bakterier. På grunnlag av den er dagens klassifisering av bakterier betydelig avklart og forutsetningene er skapt for utvikling av naturlig taksonomi og klassifisering. Av hensyn til taksonomien brukes en rekke metoder. Metode for DNA-DNA-hybridisering (deteksjon av nivået av DNA-homologi). Et mål på 60-100 % DNA-homologi anses å indikere slektskap på artsnivå. Det er imidlertid ingen generelt aksepterte kriterier. DNA-rRNA-hybridiseringsmetoden avslører genetiske forbindelser mellom regionen av DNA som kontrollerer rRNA-syntese og rRNA-nukleotider. Cistronene som er ansvarlige for rRNA-syntese er konservative og gjør det mulig å identifisere forhold på slekts- og familienivå. Den mest pålitelige metoden er DNA-sekvensering. Denne metoden avslører nukleotidsekvensen i individuelle DNA-fragmenter eller hele DNA-et til et kromosom. Det beste studieobjektet (det mest konservative) er DNA-regionen som kontrollerer syntesen av bakteriell 16S ribosomalt RNA. DNAet til dette fragmentet klones og sekvenseres deretter. DNA-sekvenseringsmetoden gjør det mulig å identifisere slektskapen til bakterier på nivå med rike, klasse, familie og slekt, men er ikke sensitiv nok til å etablere arten. Denne metoden gjør det mulig å identifisere de evolusjonære slektskapene til bakterier og er grunnleggende i gensystematikk. I de viktigste bakteriene ble den komplette sekvensen av kromosomale DNA-nukleotider (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, etc.) studert ved sekvensering.

Den genetiske mekanismen til det svært viktige medisinske problemet med ervervet medikamentresistens i bakterier har blitt avslørt.

Det er fastslått at R-plasmider som bærer gener for resistens mot 1-10 antibiotika i en hvilken som helst kombinasjon er av primær betydning i den raske utviklingen av bakteriell resistens mot antibiotika. De kan overføre antibiotikaresistensgener til mottakelige bakterier i løpet av minutter, noe som gjør hele populasjonen av bakterier i kroppen motstandsdyktig. Det er fortsatt ingen effektive midler for å fjerne R-plasmider eller blokkere deres overføring. Så langt er den virkelige prestasjonen bruken av medisiner som blokkerer aktiviteten til enzymer som ødelegger antibiotika, som kontrolleres av R-plasmider. For å inaktivere beta-laktamase brukes for eksempel klavulansyre, sulbactam, tazobaktam i kombinasjon med antibiotika fra beta-laktamgruppen.

Genetisk kontroll av bakterielle patogenisitetsfaktorer er etablert. Muligheten for å lokalisere disse genene i genomene til bakterier, bakteriofager og plasmider har blitt demonstrert. Mekanismene for dannelse av patogene stammer blant opportunistiske bakterier er identifisert. Denne informasjonen gjør det mulig å identifisere patogene bakterier ved hjelp av molekylærbiologiske metoder og målrettet skaffe avirulente vaksinestammer av mikroorganismer.

En stor prestasjon innen genetikk er utviklingen av polymerasekjedereaksjonsmetoden (PCR), som ble tildelt Nobelprisen (Mullis K., 1993). Basert på PCR er det laget et fundamentalt nytt universelt system for indikering av mikroorganismer og diagnostisering av infeksjonssykdommer – genoindikasjon. PCR-metoden lar deg amplifisere («multiplisere», klone) visse deler av DNA in vitro, og få millioner av kopier av dette DNAet på 2-4 timer. Essensen av PCR-metoden er en multippel syklisk prosess, som vekselvis inkluderer tre stadier i hver syklus - termisk denaturering av DNA (smelting), annealing (feste av syntetiske oligonukleotidprimere), syntese (fullføre den andre DNA-strengen med et termostabilt DNA). polymerase). Endringen av disse trinnene skjer som et resultat av en endring i temperaturen til reaksjonsblandingen i en spesiell forsterkeranordning (termisk syklus). Denaturering av originalen og påfølgende kopier av DNA, som fører til deling av DNA i to enkelttråder, skjer ved 90-95 ° C i 40-50 sekunder. Utglødning (tilsetning av primere) skjer ved en temperatur på 40-65 °C. Primere - syntetiske oligonukleotider (20-30 nukleotider) - festes til et enkelttrådet DNA-mål, som flankerer det ønskede spesifikke DNA-fragmentet. Primere velges slik at de begrenser det ønskede fragmentet og er komplementære til de motsatte DNA-trådene; i dette tilfellet er en primer på den ene tråden, den andre på den motsatte. Syntese (forlengelse) - fullføring av den andre DNA-strengen skjer ved 72 °C med deltagelse av Tag-DNA-polymerase. Fullføringen av den andre DNA-tråden skjer fra 5"-enden til 3"-enden av hver DNA-tråd, dvs. i motsatte retninger. Som et resultat av den første syklusen dannes to kopier av DNA-regionen begrenset av primeren. Syklusvarigheten er 2-2 minutter eller 30-40 sekunder, avhengig av typen termisk syklus. Som et resultat av hver påfølgende syklus dobles antallet syntetiserte kopier eksponentielt (fig. 3.4). Vanligvis inkluderer PCR 20-30 sykluser, som sikrer syntese av 1 million kopier av det ønskede DNA-fragmentet.

Ris. 3.4.

Elektroforese eller andre deteksjonssystemer brukes til å detektere PCR-produkter.

PCR er tilpasset for å oppdage de fleste mikroorganismer av medisinsk betydning. Den lar deg raskt oppdage ønsket mikroorganisme direkte i materialet som studeres uten å identifisere en ren kultur, og har høy følsomhet (1 x 10 1 - 1 x 10 3 mikroorganismer per 1 g materiale). PCR har funnet bred anvendelse for påvisning av vanskelige å dyrke og saktevoksende mikroorganismer (virus, klamydia, rickettsia, mykoplasma, spiroketter, mykobakterier).

LF, FIU, PF. Leksjon nr. 6

A. Grunnleggende

Organisering av genetisk materiale i bakterier.

Den arvelige informasjonen til bakterier er lagret i DNA, som i en prokaryot celle er sirkulært lukket, dobbelttrådet, supercoiled og er representert av to typer molekyler: en stor - en nukleoid, hvor vitale tegn er kodet, og små - ekstrakromosomale arvelighetsfaktorer (plasmider, transposoner, IS-sekvenser og tempererte bakteriofager), der tilleggsegenskaper er kodet.

Ekstrakromosomale arvelighetsfaktorer og deres integrering i nukleoiden.

Plasmider kan, som en nukleoid, selvreplisere og tilhører derfor autonome arvelighetsfaktorer (i motsetning til resten - ikke-autonome, som bare er i stand til å replikere som en del av en nukleoid eller plasmid i tillegg, plasmider, som tempererte fager). , kan integreres i en nukleoid bare i homologe områder, i motsetning til transposoner og IS-sekvenser som kan integreres i nukleoiden i hvilke som helst av dens områder.

Plasmider.

Plasmider utfører to mulige funksjoner i en bakteriecelle - regulatorisk (som inneholder duplikater av noen nukleoidgener) og koding (bærer gener som ikke er i nukleoiden), og kan eksistere i to tilstander (autonom, dvs. utenfor nukleoiden, og integrert i nukleoiden). nukleoid ), og avhengig av innholdet av tra-operonet i dem - være konjugert (hvis dette operonet er inneholdt i et gitt plasmid) og ikke-konjugert.

Tra operons funksjoner.

Tra-operonen bestemmer muligheten for konjugasjonsprosessen (bestemmer dannelsen av konjugative pili og prosessen med ensidig overføring av genetisk materiale gjennom dem: et plasmid eller en del av en nukleoid).

F-plasmider.

F-plasmider er selve tra-operonet, uten noen ekstra gener de bestemmer overføringen ved konjugering av seg selv, så vel som et annet DNA-molekyl som F-plasmidet er integrert i (hvis dette DNA-molekylet er et ikke-konjugerende plasmid, så som et resultat av integrasjon F-plasmid, blir det konjugering og overføres gjennom konjugasjonspilen hvis det er et DNA-molekyl - en nukleoid, så overføres dens del under konjugeringen, men ikke selve F-plasmidet).

Dannelse av forskjellige tilstander av plasmid F.

Et F-plasmid fra en autonom tilstand kan gå inn i en tilstand integrert i nukleoiden (i dette tilfellet kalles det Hfr-faktoren), og også gå tilbake til en autonom tilstand (enten ved å beholde sin sammensetning fullstendig eller "bytte ut" sin terminale region med nukleoidet - i det siste tilfellet kalles det rekombinante plasmidet et F'-plasmid).

R-plasmider.

R-plasmider er plasmider som bestemmer multimedikamentresistens (eller resistens, derav navnet) til en bakteriecelle mot antibiotika; de består av gener som bestemmer slik resistens (r-operon) og et F-plasmid (som i dette tilfellet kalles RTF-faktoren.

Sammensetning av r-operonet.

Dette operonet inneholder gener som bestemmer antibiotikaresistens, og det kan også inneholde et transposon eller en del av det - en IS-sekvens.

Mekanismer for bakteriell resistens mot antibiotika forårsaket av tilstedeværelsen av R-plasmider.

R-plasmidet kan bestemme: evnen til en bakteriecelle til å inaktivere et antibiotikum, evnen til en bakteriecelle til å modifisere et antibiotikum med sistnevnte mister sin antibakterielle aktivitet, evnen til en bakteriecelle til å redusere permeabiliteten til celleveggen til et gitt antibiotikum.

Bakteriocinogene plasmider (ved å bruke eksemplet med E. coli col-plasmid).

Bakteriocinogene plasmider bestemmer syntesen av antibiotikalignende stoffer - bakteriociner; i E. coli kalles bakteriocinogene plasmider kolisinogene (som i andre bakterier - ved artens navn) eller Col-plasmider, og bakteriociner kalles kolisiner (etter samme prinsipp).

Karakteristikker av koliciner.

Kolisiner er proteiner som dreper bakteriecellen, men som ikke lyserer den.

Transposoner.

Transposoner er nukleotidsekvenser som inkluderer IS-sekvenser (som bestemmer transposoners evne til å endre plassering i et DNA-molekyl, samt "hoppe" fra ett DNA-molekyl til et annet - de såkalte "hoppegenene"), gener som bestemmer enhver egenskap, så vel som spesielle terminalstrukturer, takket være hvilke transposoner kan være i en autonom tilstand (siden, takket være disse "klebrige endene", lukkes de i en ring).

IS-sekvenser.

IS-sekvenser inkluderer bare transposisjonsgener i motsetning til transposoner, de kan ikke være i en autonom tilstand.

Mekanismer for fagomdannelse.

Når, som et resultat av lysogenisering (dvs. integrering i genomet til en temperert bakteriofag), en bakterie får en ekstra egenskap, kan dette skyldes tre mulige mekanismer: derepresjon av profagenet, introduksjon av det tilsvarende genet av en defekt fag, eller utløsning av et "stille" gen på grunn av skade på sin egen promoter av promoterprofagen.

Modifikasjoner i bakterier.

Modifikasjoner er fenotypiske variasjoner i bakterier.

Mutasjoner i bakterier.

Med mutasjonsvariabilitet i bakterier oppstår endringer i den primære strukturen til DNA, som uttrykkes i arvelig tap eller endring av en hvilken som helst egenskap (eller egenskaper); med spontane mutasjoner er faktorene som forårsaket dem (mutagene) ukjente - oftest oppstår spontane mutasjoner som et resultat av DNA-polymerasefeil under DNA-replikasjon blant spontane mutasjoner, skilles innsettingsmutasjoner, som oppstår på grunn av integrering av ekstrakromosomale arvelige faktorer; inn i nukleoiden; induserte mutasjoner i bakterier er forårsaket eksperimentelt av virkningen av et spesifikt mutagen.

SR-dissosiasjoner.

SR-dissosiasjon er fenomenet når R-former opptrer i en ren kultur som danner S-former av kolonier; I henhold til dens mekanisme er SR-dissosiasjon en innsettingsmutasjon som fører til tap av gener som kontrollerer syntesen av LPS-polysakkaridenheter i den ytre membranen av celleveggen.

Mutagener.

Mutagener forstås som kjemiske stoffer eller fysiske faktorer som forårsaker pre-mutasjonsendringer i DNA, som som følge av feil i reparasjonsenzymer eller under reparasjonsprosessen blir til mutasjon.

Reparasjoner i bakterier.

Dette begrepet refererer til prosessen med restaurering av skadet DNA ved hjelp av enzymer i reparasjonssystemene til bakteriecellen.

Rekombinasjonsvariabilitet i bakterier.

Rekombinasjonsvariabilitet forstås som variabilitet som oppstår som et resultat av inkludering av et DNA-segment av en donorcelle i DNA til mottakercellen; i bakterier er det fem typer genetiske rekombinasjoner (dvs. fem typer rekombinasjonsvariabilitet): transformasjon (direkte overføring av genetisk materiale fra en donor til en mottakercelle), transduksjon (overføring av genetisk materiale fra en giver til en mottakercelle ved hjelp av defekte bakteriofager), konjugering (overfør genetisk materiale fra giveren til mottakercellen ved hjelp av konjugasjonspili), lysogenisering (hvor eksogent genetisk materiale introduseres i genomet til mottakercellen - genomet til en temperert fag), fagomdannelse (forskjellig fra lysogenisering bare ved at fenotypen til donorcellen endres).

Genteknologi i medisinsk mikrobiologi.

I medisinsk mikrobiologi blir det i økende grad brukt genteknologiske metoder, ved hjelp av hvilke mikroorganismer blir "tvunget" til å produsere medisiner som trengs i medisinsk praksis (vaksiner, hormoner, interferoner, cytokiner, etc.) ved å introdusere det tilsvarende genet i genomet deres, dvs. oppnå en rekombinant stamme med de ønskede egenskapene gjennom "rettet" rekombinasjonsvariabilitet.

Genetiske metoder brukt i mikrobiologisk diagnostikk.

I moderne medisin blir genetiske metoder for mikrobiologisk diagnostikk stadig mer utbredt: bestemmelse av prosentandelen av guanin og cytosin i bakteriegenomet, metoden for molekylær hybridisering, og spesielt polymerasekjedereaksjonen (PCR).

Molekylær hybridiseringsmetode.

Denne metoden brukes til å identifisere graden av likhet mellom ulike DNA (ved identifisering av mikroorganismer sammenlignes DNA fra den isolerte stammen med DNA fra referansestammen).

Polymerase kjedereaksjon.

PCR kan utføres for å oppnå tre formål: å påvise en spesifikk type mikroorganisme i patologisk materiale uten å isolere en ren kultur, å identifisere isolerte renkulturer av mikroorganismer, å genotype mikroorganismer, dvs. bestemmelse av genetiske varianter av en art; Prinsippet for PCR er å øke (amplifisere) mengden av det ønskede genet i tilfelle av en positiv reaksjon eller fravær av en slik økning i tilfelle av en negativ reaksjon (dvs. DNA ekstraheres og, hvis det inneholder det ønskede genet , øker mengden kraftig under reaksjonen, som oppdages ved hjelp av elektroforese).

B. Forelesningskurs

B. Teoretisk materiale

11. Organisering av genetisk materiale i bakterier
11.2. Plasmider
11.3. F-plasmider
11.4. R-plasmider
11.6. Transposoner
11.7. IS-sekvenser
12. Modifikasjoner, mutasjoner og reparasjoner i bakterier
12.1. Modifikasjoner i bakterier
12.2. Mutasjoner i bakterier
12.3. SR-dissosiasjon
12.4. Mutagener
12.5. Reparasjoner
13. Genetisk rekombinasjon i bakterier, genteknologi i medisinsk mikrobiologi
13.1. Typer genetisk rekombinasjon i bakterier
13.2. Genteknologi i medisinsk mikrobiologi
14. Anvendelse av genetiske metoder i mikrobiologisk diagnostikk
14.1. Molekylær hybridiseringsmetode
14.2. Polymerase kjedereaksjon

ORGANISERING AV GENETISK MATERIAL I BAKTERIER

11.1. Generell ordning for organisering av det genetiske materialet til en bakteriecelle

Organiseringen av genetisk materiale i bakterier er basert på et prinsipp som er felles for alle former på jorden. Derfor presenteres dette materialet under hensyntagen til studentenes kunnskap om det generelle genetikkkurset: bare de genetiske egenskapene som er karakteristiske for en prokaryot celle dekkes. Den arvelige informasjonen til bakterier, som alle former for cellulært liv (i motsetning til virus), lagres i DNA (fig. 11.1-1), som i en prokaryot celle er representert av to typer molekyler.

Ris. 11.1-1. DNA-strukturdiagram

A. Vitale tegn, uten hvilke en bakteriecelle ikke kan eksistere, er kodet inn nukleoid(se avsnitt 4.2).

B. Ikke-vitale tegn er kodet i bakterier under ekstrakromosomale arvelighetsfaktorer: plasmider, transposoner, IS-sekvenser og tempererte bakteriofager. Uten disse egenskapene kan en bakteriecelle eksistere under normale forhold, men ytterligere egenskaper kodet i ekstrakromosomale arvelighetsfaktorer gir en rekke celler i populasjonen ytterligere muligheter til å overleve når miljøforholdene endres, og ved å øke heterogeniteten i populasjonen øker adaptive evner til sistnevnte. For eksempel er egenskapen til resistens mot penicillin ikke nødvendig under normale forhold og påvirker ikke levedyktigheten til en bakteriecelle, men når dette antibiotikumet vises i det ytre miljøet, kan bare de bakteriene som har et plasmid som koder for den tilsvarende egenskapen, overleve. Og bare de bakteriepopulasjonene som inneholder celler som bærer det tilsvarende plasmidet kan overleve i nærvær av penicillin.

1. I henhold til evnen til å replikere seg selv ekstrakromosomale arvelighetsfaktorer er delt inn i to grupper: autonome og ikke-autonome.

EN. Autonom Ekstrakromosomale faktorer for arv i bakterier er plasmider. Dette betyr at de er i stand til å replikere uavhengig, med sin egen tilsvarende operon.

b. Ikke-autonome ekstrakromosomale arvelighetsfaktorer hos bakterier er transposoner, IS-sekvenser og tempererte fager. Uten å ha et eget operon som sikrer replikasjon, kan de replikere bare i et DNA-molekyl som har et slikt operon – enten i en nukleoid eller i et plasmid.

2. Alle ekstrakromosomale faktorer av arv i bakterier kan integreres i nukleoiden (og følgelig forlate dens sammensetning). Avhengig av plasseringen av innsetting i nukleoiden ekstrakromosomale arvelighetsfaktorer er også delt inn i to grupper.

EN. Bare i homologe områder kan integreres i nukleoiden til plasmider og tempererte bakteriofager. Dette betyr at for et bestemt plasmid og for en bestemt temperert bakteriofag er det bare ett sted i nukleoidet hvor dette spesielle plasmidet eller denne spesielle bakteriofagen kan inkluderes i nukleoiden.

b. På alle områder kan integreres i nukleoiden ved hjelp av transposoner og IS-sekvenser.

11.2. Plasmider

Plasmider er ekstrakromosomale autonome faktorer for arv hos bakterier.

A. Plasmider, som andre ekstrakromosomale faktorer av bakteriell arv, øker den genetiske heterogeniteten til bakteriepopulasjonen. Dette kan betraktes som deres hovedfunksjon, som de utfører sammen med transposoner, IS-sekvenser og tempererte bakteriofager. Spesifikt blir plasmider isolert to funksjoner: regulering og koding.

1. Plasmider kan bære de samme genene som finnes i nukleoiden. Hvis et av disse nukleoidgenene "blir stille" av en eller annen grunn, vil "identiske gener til plasmidet slå seg på - den ønskede egenskapen vil fortsatt være tilstede i fenotypen til bakteriecellen. Denne funksjonen til plasmider kalles regulatoriske.

2. Koding funksjonen til plasmider er at de kan inneholde gener som ikke er tilstede i det bakterielle kromosomet (dvs. nukleoid). Faktisk faller denne funksjonen til plasmider sammen med den generelle funksjonen til alle ekstrakromosomale arvelighetsfaktorer - for å øke heterogeniteten til genotypen til befolkningen.

B. Som de fleste andre ekstrakromosomale arvelighetsfaktorer, kan plasmider eksistere i en bakteriecelle i to stater.

1. Hvis plasmidet er lokalisert utenfor nukleoidet, i cytoplasmaet, sies det å være det autonome tilstand (ikke å forveksle med begrepet "autonom arvelighetsfaktor").

2. Plasmidet som inngår i nukleoidet er lokalisert i integrert betingelse.

B. Avhengig av innholdet i tra-operonet(som vil bli diskutert mer detaljert nedenfor) plasmider er også delt inn i to grupper.

1. Plasmider som inneholder tra-operonet kalles konjugativ, fordi slike plasmider kan forårsake overføring av genetisk materiale fra donorcellen til mottakercellen gjennom konjugeringsprosessen (se avsnitt 13.1).

EN. Tra-operonen bestemmer formasjonen konjugativ pili.

b. I tillegg bestemmer tra operon en kjede av hendelser som kalles mobilisering for overføring. I dette tilfellet avvikles først en del av dobbelttrådet DNA, deretter passerer en av trådene gjennom den konjugative pilen inn i en annen, mottaker, bakteriecelle, hvor den komplementære andre tråden er fullført. Under konjugering mister ikke donorcellen genetisk materiale, men mottakercellen erverver det (til tross for den tilsynelatende betydningen av definisjonen av konjugering som "overføring av genetisk materiale fra giveren til mottakercellen ved bruk av konjugative pili).

1 . Tra-operonen kan mobilisere seg for forflytning konjugert plasmid(som skjer ved overføring under konjugering av et F+-plasmid, se avsnitt 11.3).

2 . Tra-operonet kan rekruttere et annet, ikke-konjugativt, plasmid for overføring (slik som skjer ved overføring under konjugering av et RTF-plasmid, se avsnitt 11.4).

3 . Tra-operonet kan mobilisere en region av donorcelle-nukleoiden for overføring (som skjer under konjugering forårsaket av Hfr-plasmidet, se avsnitt 11.3).

2. Plasmider som ikke bærer tra-operonet kalles hhv. ikke-konjugativ, fordi er ikke i stand til å bestemme prosessen med konjugasjon.

D. Plasmider deles inn i to grupper og i henhold til graden av kontroll over deres replikering fra nukleoidsiden.

1. Store plasmider (dvs. de med relativt stor molekylvekt) er funnet under streng kontroll fra nukleoidsiden over replikasjonen. Nukleoiden "tillater" dem, som regel, bare en "ekstra" divisjon. Følgelig finnes slike plasmider i en eller to kopier i cellen.

2. Små plasmider (dvs. de som har en relativt lav molekylvekt) er funnet under svekket kontroll fra nukleoidsiden over deres replikasjon og kan dele seg mye oftere enn den - derfor kan opptil 30 kopier av slike plasmider samtidig være tilstede i en bakteriecelle.

D. Til slutt klassifiseres plasmider i inkompatibilitetsgrupper. Faktum er at beslektede plasmider ikke samtidig kan være tilstede i den samme bakteriecellen, fordi hvis en av dem allerede er til stede i den, vil den andre ikke lenger være i stand til å trenge inn i den (dette fenomenet kalles immunitet mot superinfeksjon og gjelder også forholdet mellom virus og en sensitiv celle). Som et resultat utgjør plasmider relatert til hverandre og inkompatible i samme celle én inkompatibilitetsgruppe. For tiden er det mer enn tjue slike inkompatibilitetsgrupper blant plasmider.

11.3. F-plasmider

F-plasmider representerer selve tra-operonet, uten noen ekstra gener. Dette plasmidet kalles også kjønnsfaktor eller en fruktbarhetsfaktor (derav navnet) fordi tilstedeværelsen av F-plasmidet gjør cellen til en mulig donor av genetisk materiale under konjugering (dvs. til en "mannlig" celle), henholdsvis en celle som mangler F-plasmidet en potensiell mottaker av genetisk materiale under konjugering ("kvinnelig" celle). Mottakercellen, etter å ha mottatt F-plasmidet under konjugering, blir derved fra hunn til mann (dvs. "kjønnsendring" skjer).

A. F-plasmidet, som er i en integrert tilstand, kalles Hfr-plasmider(høy frekvens av rekombinasjon – høy frekvens av rekombinasjon). Hvis donorcellen inneholder Hfr-faktoren under konjugering, bryter nukleoidkjeden under konjugasjonen ved festestedet for denne faktoren, og enden av DNA-et motsatt av plasseringen av Hfr-faktoren begynner å gå inn i konjugasjonsbroen. Siden konjugasjonsbroen ikke er stabil, er kontakten mellom cellene under konjugering kortvarig og hele nukleoid-DNA-kjeden rekker rett og slett ikke å passere inn i mottakercellen. Følgelig overføres ikke selve Hfr-faktoren i denne typen konjugering (kjønnsendring forekommer ikke), og nukleoidfragmentet introduseres i mottakercellen med høy frekvens (siden konjugering skjer som regel mellom celler av samme art ) rekombinerer med kromosomet til mottakercellen .

B. F-plasmid, som er i en autonom tilstand, passerer selv under konjugering inn i mottakercellen. I dette tilfellet blir mottakercellen fra "kvinne" til "mannlig" (det vil si at det skjer en kjønnsendring), men det genetiske materialet som er introdusert i mottakercellen, representert av plasmidgener, rekombineres sjelden med bakteriekromosomet, fordi det er relatert til det kromosomale genetiske materialet relativt lav grad av homologi.

B. Kjønnsfaktoren kan gå fra en autonom stat til en integreringsstat og fra en integreringsstat til en autonom. Den sistnevnte prosessen kan være ledsaget av en utveksling av tilstøtende deler av plasmidet og nukleotidet, som et resultat av at plasmidet som har gått inn i en autonom tilstand vil være rekombinasjon - det vil inneholde et fragment av nukleoidet, og etterlate sitt eget fragment i sin plass. Dette plasmidet er betegnet som F'-plasmid. Hvis donorcellen bærer F'-plasmidet under konjugering, går det over i mottakercellen, og produserer en "kjønnsendring" i sistnevnte, men forårsaker samtidig en høy frekvens av rekombinasjon (på grunn av det inkluderte nukleoidfragmentet) . Dannelsen av forskjellige tilstander av F-plasmidet beskrevet ovenfor er illustrert i fig. 11-3-1.

11.4. R-plasmider

R-plasmider er plasmider som bestemmer multimedikamentresistens (eller resistens, derav navnet) til en bakteriecelle mot antibakterielle stoffer (primært antibiotika).

EN. Sammensetning av R-plasmidet bestemt av tilstedeværelsen av to hovedoperoner. Derfor kan dette plasmidet være i to former.

1. Hvis R-plasmidet inneholder tra-operonet, så er R-plasmidet i dette tilfellet konjugativ. Tra-operonet i dette plasmidet kalles RTF-faktoren (resistensoverføringsfaktor). Gener som bestemmer resistens mot antibiotika danner det såkalte r-operonet (for å være mer presis, resistens mot hvert antibiotikum bestemmes av et separat r-operon - dvs. R-plasmidet inkluderer flere r-operoner), som i sin tur , kan også eksistere som et uavhengig plasmid. Med andre ord består det konjugative R-plasmidet av to plasmider: RTF-faktoren og r-faktoren (som kan forstås som inkludering av et mindre r-plasmid i et større RTF-plasmid).

2. Ikke-konjugativ formen til dette plasmidet består kun av r-operonet(e).

B. Inkludert i r-operonen kan inneholde mange gener.

1. For det første er dette gener som bestemmer syntese av spesifikke enzymer.

EN. Dette kan være enzymer inaktiverende antibiotika.

b. Eller enzymer antibiotika-modifiserende. I dette tilfellet mister det modifiserte antibiotikumet (for eksempel fosforylert) sin antibakterielle aktivitet.

V. Til slutt kan dette være enzymer som redusere celleveggens permeabilitet til dette antibiotikumet, som et resultat av at det ikke kan trenge inn i bakteriecellen og "komme" til målet for dets virkning (for eksempel til ribosomene for å blokkere proteinsyntesen her).

2. Og for det andre kan r-operonet inneholde en helhet transposon eller deler av det - IS-sekvens(se nedenfor).

B. Av sammensetningen av r-operonet blir det klart hovedmekanismene for bakteriell resistens mot antibiotika, forårsaket av tilstedeværelsen av R-plasmider. Det er tre av dem.

1. R-plasmidet kan bestemme evnen til en bakteriecelle inaktivere antibiotikaen.

2. Eller R-plasmidet kan bestemme evnen til en bakteriecelle på denne måten endre antibiotikaen at den vil miste sin antibakterielle aktivitet som et resultat.

3. Og til slutt kan R-plasmidet bestemme redusert celleveggpermeabilitet for et gitt antibiotikum og dermed nekte ham tilgang til målet for handlingen hans.

D. R-plasmid er ikke alltid overført gjennom konjugasjon.

1. Hos grampositive bakterier overføres R-plasmidet oftest gjennom transduksjon.

2. Gjennom konjugasjon R-plasmidet overføres oftest i gramnegative bakterier.

11.5. Bakteriocinogene plasmider (ved å bruke eksemplet med E. coli Col-plasmid)

Bakteriocinogene plasmider er iboende i nesten alle typer bakterier. De bestemmer syntesen av antibiotikalignende stoffer - bakteriociner. Vi vil se på disse plasmidene ved å bruke Escherichia coli som eksempel. Dens bakteriocinogene plasmider kalles kolisinogene (som andre bakterier - ved artens navn) eller Col-plasmider (den mest tallrike gruppen av kolisinogene plasmider), og bakteriociner kalles kolisiner (basert på samme prinsipp).

EN. Col plasmid sammensetning bestemt av tilstedeværelsen av to hovedoperoner.

1. Dette plasmidet inneholder for det første gener som bestemmer syntesen koliciner.

EN. Kolisiner er ekorn.

b. Det er mer enn 25 typer kolicin.

V. Kolisiner fungerer ikke på en celle som bærer et kolisinogent plasmid av identisk type.

d. Koliciner dreper bakteriecellen, men ikke lys det, som forhindrer oppkomsten av giftige produkter av cellulært forfall i habitatet til overlevende bakterier.

2. Og for det andre inneholder Col-plasmidet tra operon. Følgelig refererer det til konjugative plasmider.

B. Col-plasmidet skiller seg fra andre plasmider på en rekke måter som er unike for det egenskaper.

1. I motsetning til andre konjugative plasmider, Col-plasmidet integreres sjelden inn i nukleoiden. Selv om alle konjugative plasmider per definisjon er i stand til å gjøre dette, ville de ellers ikke være i stand til å mobilisere en region av det bakterielle kromosomet for overføring (se avsnitt 11.3.A).

2. Col plasmid er vanligvis undertrykt, dvs. informasjon fjernes ikke fra den. De. egenskapen som den bestemmer er ikke nødvendig av cellen under normale forhold.

3. Når denne egenskapen blir etterspurt og Col-plasmidet deprimeres, syntetiserer bakteriecellen koliciner og dør. Med andre ord er Col-plasmidet potensielt dødelig.

I. Betydning Col-plasmider kan sees fra to perspektiver.

1. Biologisk Betydningen av Col-plasmidet er at det bidrar til å oppnå populasjonssjeldne forhold når det er mangel på næringssubstrat. Dette skjer i henhold til følgende skjema (fig. 11.5-1).

EN. Populasjonen inneholder celler med ulike typer Col-plasmid (merket med ulike farger i figuren). Når næringsmediet er oppbrukt, blir Col-plasmidet i en av cellene deprimert, denne cellen syntetiserer den tilsvarende typen kolicin og dør.

b. Kolisiner virker bare på de cellene som ikke inneholder Col-plasmidet, som bestemmer syntesen av koliciner av denne spesielle typen. Følgelig forblir celler som inneholder Col-plasmidet som bestemmer syntesen av coliciner av denne typen i live.

V. Imidlertid dør andre celler i befolkningen som bærer Col-plasmider av andre typer, befolkningen blir utarmet ("det er færre spisere") og kan som et resultat forlenge livet i et utarmet miljø.

2. Medisinsk Betydningen av Col-plasmidplasmidet er at med dets hjelp regulerer E. coli, som normalt befolker menneskets tarm, normal mikrobiocenose - totalen av mikroorganismer som bor i tarmene til en frisk person, siden koliciner virker ikke bare på celler av sin egen art, men også på celler fra andre arter av bakterier i tarmgruppen.

11.6. Transposoner

Transposoner, som IS-sekvenser, kalles ofte "hoppende gener." På grunn av deres evne, i motsetning til plasmider og tempererte fager, til å integrere seg i et DNA-molekyl (nukleoid, plasmid eller temperert fag) i alle, og ikke bare homologe, regioner, kan de endre stedet for deres lokalisering i DNA-molekylet der de er integrert. I tillegg kan de også "hoppe" fra ett DNA-molekyl til et annet.

A. Transposoner gis vanligvis følgende definisjon: dette er nukleotidsekvenser (fra 2 000 til 20 000 nukleotidpar) som kan endre sin plassering i et DNA-molekyl og migrere fra ett DNA-molekyl til et annet.

B. I en bakteriecelle kan de være lokalisert i to stater.

1. Transposonen kan være plassert i integrert tilstand, dvs. integreres i et replikon (nukleoid eller plasmid) og følgelig replikeres som en del av dette replikonet.

2. Et transposon kan lokaliseres i en bakteriecelle og i autonome tilstand (dvs. utenfor replikonet). I dette tilfellet lukker den seg i en ring, men fordi den ikke er i stand til å replikere seg selv, går den under celledeling over i bare en av de to nydannede.

B. Transposon inneholder av tre hoveddeler.

1. Den inneholder spesielle endestrukturer, som skiller transposonet fra andre DNA-fragmenter som finnes i bakteriecellen og er dermed markører for denne spesielle ekstrakromosomale arvelighetsfaktoren.

2. Evnen til et transposon til å endre sin plassering i et DNA-molekyl og migrere fra ett DNA-molekyl til et annet bestemmes av spesielle transposisjonsgener(faktisk er dette IS-sekvenser).

3. I tillegg inneholder transposonet gener bestemme proteinsyntese, forårsaker tilstedeværelsen av ytterligere egenskaper i bakteriecellen som inneholder denne transposonen.

EN. Ofte bestemmer slike gener evnen til en bakteriecelle til å syntetisere et eller annet protein giftstoff.

b. Ikke mindre ofte, bestemmer en transposon bærekraft celler Til noen antibiotika(nøyaktig en, i motsetning til R-plasmidet).

V. Mindre vanlig bestemmer en transposon syntesen av proteiner som bestemmer andre tegn.

11.7. IS-sekvenser

IS-sekvenser (innsettingssekvenser) er en del av transposonet, og sikrer dens evne til å transponere.

A. IS-sekvenser er vanligvis gitt følgende definisjon: Dette er innsettinger av nukleotidsekvenser (ca. 1000 basepar) som er i stand til transposisjon.

B. IS-sekvenser er grunnleggende forskjellig fra transposoner.

1. For det første, de inneholder bare transposisjonsgener.

2. For det andre, de ikke funnet i en fri stat.

B. IS-sekvenser utfører tre hoved funksjoner.

1. Med deres hjelp gjennomføres koordinering interaksjoner av ekstrakromosomale faktorer av arv med hverandre og med det bakterielle kromosomet for å sikre deres rekombinasjon.

2. I tillegg kan de gjennomføre regulatorisk funksjon(dvs. regulere gentranskripsjon ved å "slå den på/av").

3. Til slutt IS-sekvenser kan indusere mutasjoner(inversjoner, duplikasjoner over 5-9 nukleotidpar).

11.8. Mekanismer for fagomdannelse

Her, etter å ha presentert informasjon om bakteriofagen og ekstrakromosomale arvelighetsfaktorer i bakterier, kan vi oppsummere informasjon om mekanismene for fagomdannelse (se avsnitt 10.4.B.2), når, som et resultat av lysogenisering (dvs. integrering i genomet) av en temperert bakteriofag), får bakterien ytterligere tegn.

A. For det første kan dette fenomenet skyldes derepresjon av profetgenet, som nevnt ovenfor (se punkt 10.4.B.2).

B. For det andre kan en tilleggsegenskap bestemmes av genomet til donorbakterien, introdusert i genomet til mottakerbakterien av en defekt fag når spesialisert transduksjon(Se punkt 10.4.B.2).

B. Og for det tredje, hvis en temperert bakteriofag har integrert nær den skadede promoteren til et av genene, så kan funksjonen til denne dysfunksjonelle promoteren "overtas" av profagpromotoren, gjenopprette derved uttrykk"stille" gen til mottakerbakterien.

Relatert informasjon.

Bakterier er prokaryote mikroorganismer, hvis genetiske materiale hovedsakelig er representert av et enkelt sirkulært dobbelttrådet DNA, kalt et kromosom av genetikere. I relativt sjeldne tilfeller er et kromosom representert av et lineært DNA-molekyl.

Størrelsen på dette DNA er mye større enn størrelsen på selve bakteriecellen. Så for eksempel kl E coli lengden på kromosomalt DNA er 1300 µm (1,3 mm - 4,6 x 106 bp), og cellestørrelsen er 1,1-1,5 x 2,0-6,0 µm. Dessuten fyller ikke DNA hele cellen, men finnes kun i et begrenset område, som utgjør omtrent en tredjedel av cellevolumet.

Figur 1. Bakterielt genom og diagram over dets komprimeringsnivåer.

Det følger at DNA eksisterer i en celle i en høyt ordnet (kondensert) tilstand i form av en kompakt struktur. Denne strukturen, som vagt minner om eukaryote kjerner, kalles nukleoid og er kun synlig i et mikroskop etter DNA-spesifikke flekker (fig. 1). I et elektronmikroskop fremstår det som en formasjon som består av mange løkker som strekker seg fra et tett sentralområde. Dannelse av et stort antall (opptil 140 per genom) av løkker kalles domener, er et av nivåene av DNA-komprimering. Hvert domene er forankret ved basen av et RNA-molekyl og består av omtrent 40 kb. DNA-løkkene er ikke i form av en fritt forlenget dupleks, men har et andre komprimeringsnivå på grunn av vridning til superheliske formasjoner gjennom forbindelsen med HLP-proteiner.

Disse proteinene er små i størrelse, svært basiske og binder seg tett til DNA. I aminosyresammensetningen ligner de eukaryote histoner.

Nukleoidet er ikke separert fra cytoplasmaet av kjernemembranen og er festet til mesosomer– spesifikke invaginasjoner av cytoplasmatisk membran inn i cellen. Bindingen av DNA til en spesifikk region av membranen er nødvendig for funksjonen til genomet.

Det sirkulære DNA-molekylet av bakterier (kromosom) er et selvreplikerende genetisk molekyl - replikon. Replikering starter med replikasjonsstartpunkter (ori– original ) , lokalisert, som regel, i stedet for DNA-feste til membranen. Fra startpunktet skjer replikering sekvensielt, toveis, ved bruk av en semi-konservativ mekanisme. Replikering avsluttes kl replikasjonsavslutningsregion (ter), lokalisert på en seksjon av sirkulært DNA motsatt replikasjonsorigo (fig. 2).

Ris. 3. Distribusjon av datterkopier av DNA og bakteriecelledeling.

Antall kromosomer i en bakteriecelle avhenger av utviklingsstadiet og fysiologiske forhold for kulturvekst. I det logaritmiske vekststadiet E coli per 1 nukleoid er det 2,8 DNA-ekvivalenter av ett genom, på grunn av langsom segregering av to datterkromosomer, eller reinitiering av nye sykluser av DNA-replikasjon selv før celledeling (fig. 4).

Fig.4. Antall kromosomer i en celle ved stasjonære (A) og logaritmiske (B) stadier av kulturvekst.

Hos noen bakterier inneholder celler normalt ikke én, men mange kromosomer. De kan danne en eller flere nukleoider. Det er også en avhengighet av DNA-innholdet i en celle av størrelsen, selv om dette ikke betyr en tilsvarende endring i volumet av genetisk informasjon.

Bakterie-DNA kjennetegnes ved en høy gentetthet (1 gen per 1 kb). Proteinkodende DNA utgjør omtrent 85-90 % av alt DNA. Gjennomsnittlig størrelse på DNA-sekvenser mellom gener er bare 110-125 bp. Ikke-kodende bakterielt DNA utgjør mindre enn 1 % og er vanligvis tilstede i form av transposoner. Altså i DNA-et til stammen Escherichia coli K12 linje MG 1655 fant 41 kopier av ulike transposoner (IS), som er involvert i prosessene med plasmidinnsetting og eksklusjon. Mange fager, selv om de ikke er helt utelukket fra bakteriegenomet, etterlater noen av genene deres der som et spor. Disse restene, som ikke er i stand til uavhengig bevegelse og utvikling, kalles "kryptiske" fager.

Introner er ekstremt sjeldne i bakterielle genomer. Det er tilfeller av genoverlapping, hvor ett gen finnes inne i et annet på samme DNA-streng. Bakterielle genomer er preget av operoner: E coli 27 % av de predikerte transkripsjonsenhetene er operoner.

En bakteriecelle kan inneholde andre replikoner som kan eksistere separat fra det bakterielle kromosomet. De kalles plasmider. Plasmider er sirkulære (i noen arter lineære) dobbelttrådete DNA-molekyler av forskjellige størrelser fra 1000 bp. opptil nesten en tredjedel av størrelsen på selve bakteriekromosomet. Antall og rekkevidde av plasmider i bakterieceller kan variere. Forskjeller i spekteret av plasmider observeres ofte selv mellom celler av forskjellige stammer av samme bakterieart. Noen plasmider kan settes inn i det bakterielle kromosomet, som utgjør en del av det bakterielle replikonet, og kan ekskluderes fra det igjen, og gjenopprette formen til et autonomt replikon. Slike plasmider kalles episomer.

Profager kan også inkluderes i arvestoffet til bakterier.

Innholdsfortegnelse for emnet "Vurdering av bakterievekst. Sporulering av bakterier. Genetikk av bakterier.":
1. Tofasevekst av bakterier. Diauxia. Vekst uten deling. Vurdering av bakterievekst. Kvantitativ vurdering av bakterievekst.
2. Faktorer som påvirker veksten av bakterier. Kulturmedier for bakterievekst. Enkle og komplekse kulturmedier. Faste og flytende kulturmedier.
3. Temperatur på bakterievekst. Mesofile bakterier. Termofile bakterier. Psykrofile bakterier. Lufting av bakterier.
4. pH-verdien som kreves for bakterievekst. Bakterielle pigmenter. Typer pigmenter. Funksjoner av bakterielle pigmenter.
5. Sporulering av bakterier. Bakteriesporer. Sporangia. Endosporer. Eksosporer.
6. Morfologi av bakteriesporer. Strukturen til en bakteriespore. Strukturen til en bakteriespore.
7. Sporulering av bakterier. Stadier av sporulering i bakterier. Plassering av sporer i bakterier.
8. Spiring av bakteriesporer. Sporeaktivering. Sovende (ikke-kulturerbare) former for bakterier.

10. Ekstrakromosomale faktorer av bakteriell arv. Bakterielle plasmider. Typer plasmider. Funksjoner av bakterielle plasmider.

I dag kan molekylærbiologi betraktes som et prioritert område innen naturvitenskap. Den er nært beslektet med mikrobiologi og er på en måte dens hjernebarn, siden den bruker bakterier og virus som hovedmodeller, og et av hovedområdene innen molekylærbiologi er molekylær genetikk- i lang tid var ikke noe mer enn genetikken til bakterier og bakteriofager.

Studerer genetikk til bakterier Det har også utvilsomt anvendt interesse, for eksempel når det gjelder å etablere mekanismene for overføring av patogene egenskaper og medikamentresistens.

Bakterier er en praktisk modell for genetisk forskning. De kjennetegnes ved: den relative enkelheten til genomstrukturen, som gjør det mulig å identifisere mutanter med en frekvens på 10 -9 og lavere; haploidy, unntatt fenomenet dominans; seksuell differensiering i form av donor- og mottakerceller; tilstedeværelsen av separate og integrerte DNA-fragmenter (plasmider, transposoner, etc.); enkel dyrking og muligheten for å oppnå populasjoner som inneholder milliarder av mikrobielle kropper.

Som andre organismer er helheten av gener i en bakteriecelle genom- bestemmer dens egenskaper og egenskaper ( genotype). Bakteriell celle fenotype- resultatet av interaksjoner mellom bakterien og miljøet - kontrollerer også genomet (siden selve egenskapene er kodet i bakteriegener).

Genetisk materiale av bakterier

Kjernefysiske strukturer av bakterier har en karakteristisk struktur som skiller dem fra kjernene til eukaryote celler; de er dannet av såkalte kromatinlegemer, eller nukleoider, blottet for et skall og inkluderer nesten alt av bakteriell DNA.

Kjernefysiske strukturer kan observeres under et fasekontrastmikroskop, hvor de fremstår som mindre tette områder av cytoplasma. For å identifisere dem i faste utstryk ble Feulgen-Rossenböck-reaksjonen foreslått.

I voksende bakterieceller nukleoider aktivt dele, når antallet noen ganger 2-4.

Prokaryot genom

U bakterie vanligvis er det en stengt ringkromosom, som inneholder opptil 4000 individuelle gener som er nødvendige for å opprettholde den vitale aktiviteten og reproduksjonen av bakterier, det vil si at bakteriecellen er haploid, og kromosomdobling er vanligvis ledsaget av dens deling.

Noen arter (for eksempel Brucella melitensis) inneholder stabilt to ringkromosomer, andre (Leptospira interrogans) - ett sirkulært kromosom og ett stort plasmid, andre - ett lineært kromosom (Streptomyces ambofaciens), det vil si at de har komplekse genomer.

Bakterielt kromosom inneholder opptil 5*10 6 basepar. Til sammenligning: genom menneske er 2,9 * 10 9 basepar. Lengden på det bakterielle kromosomet i utfoldet tilstand er ca. 1 mm (Escherichia coli).

Noen bakterier inneholder ekstrakromosomale DNA-molekyler ( plasmider) og transponerbare elementer (enten plasmid eller kromosomale).