Микросомальное окисление повышает реакционную способность молекул. P450 цитохромы Ингибиторы цитохрома 450

Цитохром р450 (CYP 450) – так называется большая семья универсальных ферментов организма человека, отвечающих за метаболизм большинства лекарств и других чужеродных органических соединений (ксенобиотиков) .

Метаболизм многих классов лекарственных средств (антигистаминных препаратов, ингибиторов ретровирусной протеазы, бензодиазепинов, блокаторов кальциевых каналов и др.) происходит с участием цитохромов.

Помимо этого, цитохромы обеспечивают различные физиологические процессы, включая биосинтез стероидов и холестерина, метаболизм жирных кислот и обеспечение кальциевого обмена (гидроксилирование витамина D3, составляющее первый этап в образовании кальцитриола).

История цитохрома р450

Цитохром Р450 был открыт в конце 50-х годов ХХ века М. Клингенбергом и Д. Гарфинкелем. Термин «цитохром» (cito –клетка; с hromos –цвет) появился в 1962 г. как временное название для обнаруженной в клетках окрашенной субстанции.

Как оказалось, различные виды цитохрома Р450 широко распространены в клетках микроорганизмов, растений и млекопитающих. Отсутствуют эти ферменты только у анаэробных бактерий.

Ученые предполагают, что все гены, кодирующие разные виды CYР450, произошли от одного гена-предшественника, который существовал еще два биллиона лет назад. Функция этого «оригинального» гена заключалась в утилизации энергии. На данный момент в природе обнаружено более 1000 различных видов цитохрома CYP 450.

Разнообразие цитохромов

На сегодняшний день у млекопитающих обнаружено около 55 различных видов цитохромов, у растений – более 100.

Благодаря успехам генной инженерии, удалось установить, что ферменты семейства цитохромов выполняют различные функции, что и обусловливает их деление на три основных класса:

участвующие в метаболизме лекарственных препаратов и ксенобиотиков;
участвующие в синтезе стероидов;
участвующие в других важных эндогенных процессах, протекающих в организме.

Классификация цитохромов

Все цитохромы и гены, кодирующие их синтез, называют в соответствии со следующими рекомендациями:

в названии цитохрома обязательно указывается корень CYP;
в названии гена, кодирующего синтез соответствующего цитохрома, также присутствует CYP , но прописанный наклонным шрифтом;
цитохромы разделены на семейства (обозначаются цифрами), подсемейства (обозначаются буквами) и изоформы (обозначаются цифрами, отражающими номер кодирующего гена).

Например, CYP 2 D 6 относится ко 2-му семейству, подсемейству D , кодируется геном 6. Название же самого гена выглядит как CYP 2 D 6.

Основные цитохромы

Несмотря на разнообразие цитохромов в организме человека, метаболизм лекарственных средств происходит с участием преимущественно ограниченного количества CYP 450. Наиболее распространенными представителями этой группы являются: CYP 1А2, CYP 2С9, CYP 2С19, CYP 2 D 6, CYP 2E1, CYP 3A4.

Эти ферменты катализируют широкий спектр метаболических реакций:

один цитохром может метаболизировать несколько лекарственных препаратов, имеющих различную химическую структуру;
один и тот же лекарственный препарат может подвергаться воздействию различных CYP 450 в разных органах и системах человеческого организма.

Двойственность природы цитохромов P450

В большинстве случаев жирорастворимые лекарственные средства и другие химические субстанции трансформируются в водорастворимые метаболиты, которые легче выводятся из организма. Введение гидроксильных групп (благодаря цитохрому Р450) увеличивает полярность молекул и их растворимость, что также способствует их выведению из организма. Почти все ксенобиотики, попадающие в печень, окисляются какой-либо изоформой цитохрома р450.

Однако те же ферменты, катализирующие процессы «очищения», могут активировать инертные химические молекулы до высоко реактивного состояния. Такие молекулы-посредники могут взаимодействовать с белками и ДНК.

Таким образом, воздействие цитохромов р450 может произойти по одному из двух конкурентных путей: метаболической детоксикации либо активации.

Вариабельность действия цитохромов

Для каждого человека характерен свой метаболизм лекарственных веществ, отличающийся от такового других людей. Индивидуальные особенности зависят от генетических факторов, возраста пациента, его пола, состояния здоровья, характера питания, сопутствующей фармакотерапии и т.д.

Генетическая вариабельность лекарственного метаболизма была установлена случайно: стандартные дозы лекарств неожиданно вызывали нестандартные реакции у разных индивидуумов.

Активность ферментов бывает двух (иногда трех) основных видов: интенсивная и слабая (средняя), соответственно метаболизм лекарственных веществ может происходить быстро и медленно.

Цитохромы и метаболизм лекарственных средств

Цитохром CYP 1А2 участвует в метаболизме многих лекарств, включая эуфиллин и кофеин. Активность этого фермента повышается под воздействием химических веществ, попадающих в организм человека во время курения.

Цитохром CYP 2А6 играет важную роль в метаболизме кумарина (непрямой антикоагулянт) и никотина.

Цитохром CYP 2С9 вовлечен в метаболизм фенитоина, толбутамида, варфарина. Если в структуре гена, кодирующего синтез данного цитохрома, изменяется хотя бы одна аминокислота, то нарушается его ферментативная активность. Ферментная недостаточность этого цитохрома обусловливает врожденную предрасположенность к интоксикации фенитоином и к осложнениям в результате терапии варфарином.

Цитохром CYP 2С19 участвует в метаболизме омепразола, диазепама, имипрамина. Однако клиническое значение полиморфизма этого фермента остается спорным. Эффективные дозы многих препаратов, метаболизируемых CYP 2С9, столь далеки от токсических, что потенциальные отклонения в активности цитохрома CYP 2С9 не играют значительной роли.

Цитохром CYP 2 D 6 является примером генотипических различий среди разных этнических групп. В 70-х годах прошлого столетия изучали фармакокинетику антигипертензивного препарата дебризохина и антиаритмика спартеина. Получены следующие результаты: при общей тенденции к сверхбыстрому метаболизму дебризохина, среди лиц европеоидной расы медленный метаболизм наблюдался в 5–10% случаев, среди японцев этот показатель составил менее 1%.

Препараты, метаболизируемые CYP2D6 (b -блокаторы, антиаритмики, психоаналептики, антидепрессанты и наркотические анальгетики), имеют узкий терапевтический индекс, т.е. между дозой, необходимой для достижения лечебного эффекта, и токсической дозой существует небольшая разница. В такой ситуации индивидуальные отклонения в метаболизме лекарств могут сыграть драматическую роль: повышение концентрации последнего до токсического уровня, либо снижение до потери эффективности.

История применения пергексилина (Австралия) ярко продемонстрировала огромное значение полиморфизма CYP2D6. После первого опыта назначений препарат был изъят из арсенала средств для лечения стенокардии вследствие высокой гепато- и нефротоксичности. Но в настоящее время пергексилин опять применяется и признан высокоэффективным средством, поскольку является токсичным только для пациентов со слабым метаболизмом CYP2D6. Безопасность назначения пергексилина обеспечивается предварительным определением индивидуального уровня этого цитохрома.

Цитохром CYP 3А4 предположительно метаболизирует около 60% всех лекарственных веществ. Это основной цитохром печени и кишечника (от общего количества цитохромов он составляет 60%). Активность его может повышаться под влиянием рифампицина, фенобарбитала, макролидов и стероидов.

Ингибирование метаболизма лекарственных средств

Ингибирование метаболизма лекарственных средств является наиболее частой причиной клинически значимого медикаментозного взаимодействия, что приводит к нежелательному повышению концентрации препарата в крови. Чаще всего это происходит, когда два различных лекарства конкурируют между собой за возможность быть связанными с одним ферментом. Лекарство, «проигравшее» в этой конкурентной «борьбе», теряет возможность адекватно метаболизироваться и избыточно накапливается в организме. Отрадно, что существует не так много препаратов, обладающих характеристиками выраженного ингибитора. Характерными ингибиторами являются циметидин, эритромицин, кетоконазол и хинидин. Среди более новых препаратов потенциальными ингибиторными свойствами обладают селективные ингибиторы обратного захвата серотонина и ингибиторы протеаз.

Скорость ингибирования зависит от фармакокинетических свойств «конфликтующих» препаратов. Если и ингибитор, и лекарство-субстрат имеют короткий период полураспада (например, циметидин и ингибитор его метаболизма – теофиллин), взаимодействие окажется максимальным на 2–4-й день. Столько же времени потребуется для прекращения эффекта взаимодействия.

В случае одновременного применения варфарина и амиодарона для прекращения ингибиторного эффекта потребуется 1 мес и более, что связано с длительным периодом полураспада последнего.

Несмотря на то, что ингибирование цитохромопосредованного метаболизма является большой проблемой, в клинической практике иногда создаются условия, позволяющие целенаправленно использовать этот феномен. Антивирусный препарат саквинавир имеет очень низкую биодоступность, что связано с его интенсивным метаболизмом цитохромом CYP 3A4. Биодоступность лекарства при приеме внутрь составляет всего 4%. Одновременное введение родственного препарата ритинавира, подавляющего активность цитохрома, приводит к 50-кратному повышению плазменной концентрации саквинавира, что позволяет достичь терапевтического эффекта.

Индукция метаболизма лекарственных средств

Индукция метаболизма возникает, когда какой-либо препарат стимулирует синтез ферментов, вовлеченных в метаболизм другого лекарства (или уменьшает естественное разрушение этих ферментов).

Наиболее хорошо известным идуктором цитохрома является рифампицин, который повышает уровни CYP 3A4 и CYP 2С в печени, в результате чего интенсифицируется метаболизм целого ряда лекарственных препаратов (таблица).

Вполне обоснованным является предположение, что индукторы цитохромов уменьшают эффективность лекарств-субстратов. Однако существует и другая сторона этого явления. Внезапная отмена лекарства-индуктора (или прекращение воздействия индуктора из окружающей среды) может неожиданно привести к сильному повышению плазменной концентрации препарата, который ранее интенсивно метаболизировался. Примером может служить ситуация, когда курильщики, привыкшие к постоянному употреблению кофе, решают внезапно бросить курить, в результате чего снижается активность CYP 1А2, а в плазме крови повышается концентрация кофеина. Это может усугублять выраженность синдрома отмены: головную боль и возбуждение.

Взаимодействие цитохромов с пищей

В результате исследования, проведенного в 1991 г., было установлено, что один стакан грейпфрутового сока вызывает трехратное повышение плазменного уровня фелодипина. При этом другие соки не вызывали подобного эффекта. Предполагается, что компоненты грейпфрута – флавониды или фуранокоумарин – подавляют метаболизм фелодепина в кишечнике, опосредованного цитохромом CYP 3А4.

Фармакогеномика и ее перспективные направления

Науку, изучающую генетически определенную реакцию организма на лекарственные препараты, с недавнего времени стали называть фармакогеномикой . Развитие этой науки позволит точно предсказывать индивидуальный ответ организма на определенное лечение, а также выявлять пациентов с высоким риском развития токсических реакций.

Таблица. Основные виды цитохромов р450 у человека

Цитохром	Субстраты, на которые осуществляется воздействие	Ингибитор	Индуктор
	Амитриптилин, кофеин, кломипрамин, имипрамин, клозапин, мексилетин, эстрадиол, парацетамол, пропранолол, такрин, теофиллин, R -варфарин	Циметидин, флувоксамин, фторхинолоновые антибиотики (ципрофлоксацин, норфлоксацин), грейпфрутовый сок	Омепразол, фенобарбитал, фенитоин, полициклические ароматические гидрокарбонаты (например шашлык), курение сигарет
	Диклофенак, индометацин, лосартан, напроксен, фенитоин, пироксикам, толбутамид, S -варфарин	Амиодарон, хлорамфеникол, циметидин, флуконазол, флуоксетин, изониазид, омепразол, сертралин, сульфинпиразон	Рифампицин
	Кломипрамин, клозапин, диазепам, имипрамин, лансопразол, омепразол, фенитоин, пропранолол	Флуоксетин, флувоксамин, изониазид, омепразол, сертралин	Рифампицин
	Амитриптилин, хлорпромазин, кломипрамин, клозапин, кодеин, дезипрамин, декстрометорфан, доксепин, флуоксетин, галоперидол, имипрамин, лабеталол, метадон, метопролол, прокаинамид, прометазин, пропафенон, пропранолол, тиоридазин, тимолол	Амиодарон, циметидин, галоперидол, мибефрадил, хинидин, пропафенон, все ингибиторы обратного захвата серотонина
	Кофеин, этанол, парацетамол, теофиллин	Циметидин, дисульфирам	Этанол, изониазид
	Амиодарон, амитриптилин, аторвастатин, бупренорфин, карбамазепин, кларитромицин, кломипрамин, клоназепам, кокаин, кортизол, циклофосфамид, циклоспорин, дексаметазон, дигитоксин, дилтиазем, диазепам, доксорубицин, эритромицин, фелодипин, фентанил, имипрамин, кетоконазол, лоратадин, миконазол, мидазолам, нифедипин, эстрадиол, омепразол, пропафенон, хинидин, симвастатин, теофиллин, верапамил, винкристин, варфарин	Амиодарон, каннабиноиды, циметидин, кларитромицин, клотримазол, дилтиазем, эритромицин, грейпфрутовый сок, кетоконазол, метронидазол, миконазол	Карбамазепин, глюкокортикоиды, фенитоин, рифампицин, сульфадимидин

Микросомальное окисление – это последовательность реакций с участием оксигеназ и НАДФН , приводящих к внедрению атома кислорода в состав неполярной молекулы и появлению у нее гидрофильности и повышает ее реакционную способность..

Реакции микросомального окисления осуществляются несколькими ферментами, расположенными на мембранах эндоплазматического ретикулума (в случае in vitro они называются микросомальные мембраны). Ферменты организуют короткие цепи, которые заканчиваются цитохромом P 450 .

Реакции микросомального окисления относятся к реакциям фазы 1 и предназначены для придания гидрофобной молекуле полярных свойств и/или для повышения ее гидрофильности, усиления реакционной способности молекул для участия в реакциях 2 фазы. В реакциях окисления происходит образование или высвобождение гидроксильных, карбоксильных, тиоловых и аминогрупп, которые и являются гидрофильными.

Ферменты микросомального окисления располагаются в гладком эндоплазматическом ретикулуме и являются оксидазами со смешанной функцией (монооксигеназами).

Цитохром P450

Основным белком микросомального окисления является гемопротеин – цитохром Р 450 . В природе существует до 150 изоформ этого белка, окисляющих около 3000 различных субстратов. Соотношение разных изоформ цитохрома Р450 различается в силу генетических особенностей. Считается, что одни изоформы участвуют в биотрансформации ксенобиотиков, другие – метаболизируют эндогенные соединения (стероидные гормоны, простагландины, жирные кислоты и др.).

Цитохром Р450 взаимодействует с молекулярным кислородом и включает один атом кислорода в молекулу субстрата, способствуя появлению (усилению) у нее гидрофильности, а другой – в молекулу воды. Основными его реакциями являются:

окислительное деалкилирование, сопровождающееся окислением алкильной группы (при атомах N, O или S) до альдегидной и ее отщеплением,
окисление (гидроксилирование) неполярных соединений с алифатическими или ароматическими кольцами,
окисление спиртов до соответствующих альдегидов.

Работа цитохрома Р 450 обеспечивается двумя ферментами:

НАДН‑цитохром b 5 ‑оксидоредуктаза , содержит ФАД ,
НАДФН‑цитохром Р 450 ‑оксидоредуктаза , содержит ФМН и ФАД .

Схема взаиморасположения ферментов микросомального окисления и их функции

Обе оксидоредуктазы получают электроны от соответствующих восстановленных эквивалентов и передают их на цитохром Р 450 . Этот белок, предварительно присоединив молекулу восстановленного субстрата, связывается с молекулой кислорода. Получив еще один электрон, цитохром P 450 осуществляет включение в состав гидрофобного субстрата первого атома кислорода (окисление субстрата). Одновременно происходит восстановление второго атома кислорода до воды.

Последовательность реакций гидроксилирования субстратов с участием цитохрома Р450

Существенной особенностью микросомального окисления является способность к индукции или ингибированию, т.е. к изменению мощности процесса.

Индукторами являются вещества, активирующие синтез цитохрома Р 450 и транскрипцию соответствующих мРНК. Они бывают

1. Широкого спектра действия, которые обладают способностью стимулировать синтез цитохрома Р 450 , НАДФН-цитохром Р 450 -оксидоредуктазы и глюкуронилтрансферазы. Классическим представителем являются производные барбитуровой кислоты – барбитураты, также в эту группу входят диазепам , карбамазепин , рифампицин и др.

2. Узкого спектр а действия, т.е. стимулируют одну из форм цитохрома Р 450 – ароматические полициклические углеводороды (метилхолантрен , спиронолактон ), этанол.

Например, этанол стимулирует синтез изоформы Р 450 2Е1 (алкогольоксидаза) которая участвует в метаболизме, этанола, нитрозаминов, парацетамола и др.
Глюкокортикоиды индуцируют изоформу Р 450 3А.

Ингибиторы микросомального окисления связываются с белковой частью цитохрома или с железом гема. Они делятся на:

1. Обратимые

прямого действия – угарный газ (СО ), антиоксиданты ,
непрямого действия , т.е. влияют через промежуточные продукты своего метаболизма, которые образуют комплексы с цитохромом Р 450 – эритромицин .

2. Необратимые ингибиторы – аллопуринол , аминазин , прогестерон , оральные контрацептивы , тетурам , фторурацил ,

Оценка реакций 1-й фазы

Оценку микросомального окисления можно проводить следующими способами:

определение активности микросомальных ферментов после биопсии,
по фармакокинетике препаратов,
с помощью метаболических маркеров (антипириновая проба ).

Антипириновая проба

Обследуемый принимает утром натощак амидопирин из расчета 6 мг/кг веса. Собирается 4 порции мочи в интервале соответственно от 1 до 6 часов, 6-12, 12-24 и 45-48 часов. Объем мочи измеряется. Не позже, чем через 24 часа моча центрифугируется или фильтруется. Далее исследуется концентрация 4-аминоантипирина и его метаболита N-ацетил-4-аминоантипирина в моче.

Цитохромы Р 450 (КФ 1. 14. 1) – семейство гемсодержащих монооксигеназ, осуществляющих метаболизм ксенобиотиков, в том числе лекарственных препаратов. Локализованы в гладком эндоплазматическом ретикулуме клетки, открыты – Д. Гарфинкель, М. Клингенберг, 1958.

Цитохром Р 450 (англ. Cytochrome P 450, CYP) Название указывает на то, что он окрашен (Р – от английского Pigment). Цитохром Р 450, связанный с монооксидом углерода, имеет максимум поглощения света при длине волны 450 нм, что определило его название (Т. Омура и Р. Сато в 1964 г.). СО не имеет никакого отношения к функции Р 450. Он добавляется для того, чтобы облегчить определение содержания Р 450 по интенсивности спектра поглощения.

Использование термина «цитохром» применительно к гемопротеинам класса Р 450 нельзя считать удачным, так как функцией цитохромов является перенос электронов, а не катализ монооксигеназных реакций. Цитохром Р-450 относится к цитохромам типа b. Предшественник гема – протопорфирин IX.

Молекулярная масса различных цит. Р 450 колеблется 44 - 60 к. Да. Мономеры гемопротеина состоят из одной полипептидной цепи, содержащей от 45 до 55% неполярных аминокислотных остатков. Полная аминокислотная последовательность установлена для более чем 150 цит. Р 450. С помощью рентгеновской кристаллографии детально изучена трехмерная структура цит. Р 450 из P. putida. Белок содержит 414 аминокислотных остатков, М. м. - 47 к. Да, представляет собой асимметричную призму с основанием 3, 0 нм и сторонами по 5, 5 и 6, 0 нм.

Цит. Р 450 из P. putida содержит 4 антипараллельных спиральных участка, смесь спиралей и неупорядоченных структур, перемежающихся параллельными бета-структурами. Гем расположен между двумя параллельными спиралями. С пропионовыми группами гема взаимодействуют остатки Arg-112, Arg-229 и His-335. Другие аминокислоты, окружающие гем, неполярны. Гем не выходит на поверхность молекулы. Наименьшее расстояние от поверхности до гема составляет около 0, 8 нм.

Все мембранные цитохромы Р 450 на N-концевом фрагменте пептидной цепи имеют короткий гидрофобный участок, содержащий от 12 до 21 аминокислотных остатков. Он выполняет роль якорного пептида и содержит сигнальную последовательность, ответственную за встраивание белка в мембрану. За ним расположена стопсигнальная последовательность, останавливающая встраивание пептида в фосфолипидный бислой.

Цитохромы P 450 отсутствуют только у облигатно анаэробных организмов. Описано не менее 11 500 ? белков системы Цит. P 450 бактерий и архей растворены в цитоплазме. Переход к эукариотическим системам сопровождался встраиванием P 450 в мембрану. Все цит. P 450 высших организмов - мембранные ферменты. В эволюционном плане наиболее древней является бактериальная монооксигеназа.

Система цит. P 450 участвует в окислении многочисленных соединений, как эндогенных, так и экзогенных. Цит. Р 450 -зависимые монооксигеназы катализируют расщепление различных веществ с участием донора электронов и молекулярного кислорода. В этой реакции один атом кислорода присоединяется к субстрату, а второй восстанавливается до воды. Центр связывания кислорода – высокоспецифичен, центр связывания преобразуемого субстрата – относительно.

Ферменты семейства цитохрома P 450 разнообразны и различаются: по функциям, типами ферментативной активности, регуляторами активности (ингибитораи, индукторами). Отдельные изоформы (изоферменты) цит. Р-450 отличаются определенной специфичностью и каждая из них участвует в метаболизме относительно небольшого количества веществ.

Цитохром Р 450, наряду с монооксигеназной активностью, может проявлять оксидазную (А. И. Арчаков с сотр.), т. е. катализировать удаление водорода из субстрата, используя при этом в качестве акцептора водорода кислород и восстанавливать его до воды, или генерировать активные формы кислорода в виде супероксидного и гидроксильного радикалов, пероксида водорода. Р 450 обнаруживает пероксидазную активность, используя в реакциях окисления в качестве косубстратов вместо NADPH органические пероксиды или пероксид водорода. Имеются данные, что Р 450 может катализировать диоксигеназные реакции, вводить в окисляемое вещество два атома кислорода. Таким образом, характерной особенностью Р 450 является множественность функций, но основной является монооксигеназная.

Цит. P-450 кодируются суперсемейством генов. У человека в системе цит. Р-450 выявлено 57 генов и более 59 псевдогенов (нефункциональные аналоги структурных генов, утратившие способность кодировать белок и не экспрессирующиеся в клетке. Термин «псевдоген» был впервые предложен в 1977 году.). Nebert (1987) была разработана классификация цит. Р-450, основанная на дивергентной эволюции и гомологии последовательностей нуклеoтид/ аминокислотной. Суперсемейство подразделяется на 18 семейств и 43 подсемейства. Номенклатура генов цит. Р-450 человека описана подробно.

В настоящее время известны тысячи изоформ (изоферментов) цит. Р-450. Изоформы, имеющие более 40 % общего аминокислотного состава, объединены в семейства и обозначаются арабскими цифрами (CYP 1, CYP 2, CYP 3 и т. д.). Подсемейства обозначаются латинскими буквами и объединяют изоформы с идентичностью аминокислотного состава более 55 % (CYP 2 D, CYP 3 A и т. д.) В подсемействе отдельные изоформы обозначаются арабскими цифрами, следующими за латинскими буквами (CYP 1 A 2, CYP 2 D 6, CYP 3 A 4). Ксенобиотик может быть субстратом двух и более изоформы. Разные изоформы способны метаболизировать одно вещество в различных участках его молекулы

Цит. P 450 катализируют ω-окисление насыщенных жирных кислот (ж. к.), перекисное окисление ненасыщеных ж. к. , гидроксилирование стероидных гормонов, желчных кислот и холестерола, биосинтез простагландинов (локализованы в митохондриях, на ядерной мембране). Цитохромы P 450 микросом участвуют в метаболической биотрансформации ксенобиотиков (лекарств, ядов, наркотических веществ). В метаболизме ЛС принимают участие изоформы семейств I, II и III, из них основные - IA 1, 1 А 2, 2 А 6, 2 В 6, 2 D 6, 2 С 9, 2 С 19, 2 Е 1, ЗА 4.

Общие индукторы Ферменты Индуктор Фенобарбита Тяжелые металлы л Система цитохрома P 450 Индуктор Противоопухолевые лекарства Метилхолантрен Система цитохрома P 448 Эпоксидгидролазы Глутатион и УДФглюкуронилтрансферазы Синтез GSH Металлотионеины Р-гликопротеин Индуктор

Фенобарбитал активирует синтез цит. Р 450, УДФглюкуронилтрансферазы и эпоксид гидролазы. Например, у животных, которым вводили индуктор фенобарбитал, увеличивается площадь мембран ЭР, которая достигает 90 % всех мембранных структур клетки, и, как следствие, - увеличение количества ферментов, участвующих в обезвреживании ксенобиотиков или токсических веществ эндогенного происхождения. Одновременный прием фенобарбитала и некоторых лекарственных препаратов, метаболизирующих при участии цит. Р 450, приводит к снижению эффективности последних за счет трансформации молекулы в процессе биотрансформации или быстрого их удаления из организма.

В настоящее время описано более 250 химических соединений, вызывающих индукцию микросомальных ферментов. Индукторы монооксигеназных систем разделяются на два класса. Представители первого класса (инсектициды, этанол и др.) вызывают выраженную пролиферацию гладкого эндоплазматического ретикулума в гепатоцитах и увеличение активности цитохрома Р 450. Стимуляция метаболизма, вызываемая индукторами второго класса (ПАУ - полициклические ароматические углеводороды: тетрахлордибензодиоксин, 3 -метилхолантрен, бенз(а)пирен и др. , не сопровождается пролиферацией гладкого эндоплазматического ретикулума, но при этом существенно возрастает активность многих ферментов биотрансформации. Усиление метаболизма большинства ксенобиотиков приводит к снижению токсичности. Вместе с тем токсичность некоторых ксенобиотиков под воздействием индукторов существенно возрастает. Например, усиливается токсичность четыреххлористого углерода, бромбензола, иприта и т. д.

Имеются химические вещества, способные ингибировать как ферменты 1 -й фазы биотрансформации (изоферменты цитохрома Р-450) и 2 -й фазы биотрансформации (N- ацетилтрансфераза и др.), так и транспортеры 3 -й фазы (РАТФазы). При снижении активности ферментов метаболизма возможно развитие побочных эффектов, связанных с длительной циркуляцией этих соединений в организме. Ингибирование транспортеров, как и их индукция, может приводить к различным изменениям (преимущественно к повышению) концентрации ксенобиотиков в плазме крови в зависимости от функций данного транспортера.

Элетронтранспортные цепи ЭПР 1 цепь включает: 1) цитохром P 450, имеет центры связывания для O 2 и гидрофобного субстрата; 2) NADPH-цитохром P 450 редуктазу, содержащую коферменты FAD и FMN; 3) NADPH+H+ – донор ē и Н+ в этой электрон-транспортной цепи; 4) O 2. 2 цепь включает: 1) цитохром P 450; 2) фермент NADH-цитохром b 5 редуктазу, коферментом которой является FAD; 3) цитохром b 5 – гемопротеин, переносящий ē от NADH-цитохром b 5 редуктазы на цитохром P 450; 4) NADH + Н+ – донор ē и Н+; 5) O 2. Цитохром P 450 один атом O 2 включает в молекулу субстрата, а 2 -й восстанавливает с образованием H 2 O за счет переноса ē и Н+ от NADPH+H+ при участии цитохром P 450 -редуктазы (или от NADH+H+ с помощью цитохром b 5 редуктазы и цитохрома b 5).

Еще одна схема организации электронтранспортной цепи ЭПР Источником электронов и протонов в цепи является НАДФН+Н+, который образуется в реакциях пентозофосфатного пути окисления глюкозы. Промежуточным акцептором Н+ и е- служит флавопротеин, содержащий кофермент ФАД (цитохром Р 450 -редуктаза). Конечное звено в цепи микросомального окисления - цитохром Р 450, восстанавливающий кислород до воды. Работа системы цит. Р-450 сопряжена с работой системы цит. b-5, источником электронов и протонов в которой является НАДН+Н+, образующийся в гликолизе. Промежуточным акцептором Н+ и е- служит флавопротеин, содержащий кофермент ФАД (цитохром b-5 -редуктаза).

Пример RH – субстрат цит. Р-450; стрелками показаны реакции переноса электронов. Восстановленную форму цит. -b 5 окисляет стеароил-Ко. А-монооксигеназа, которая переносит электроны на О₂. Один атом О₂ принимает 2 е¯ и переходит в форму О²¯. Донором электронов служит НАДФН, который окисляется НАДФН-цит. Р-450 редуктазой. О²¯ взаимодействует с протонами с образованием воы: О²¯ + 2 Н⁺ → Н₂О Второй актом кислорода включается в субстрат RH, образую гидроксильную группу вещества R-OH.

НАДФ-Н-цитохром Р-450 -редуктаза – флавопротеин. Один моль фермента содержит по одному молю флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД). Поскольку цитохром С может служить акцептором электрона (используется в модельных системах), указанный фермент часто называют НАДФ-цитохром Средуктазой.

Механизм гидроксилирования субстрата при участии цитохрома Р-450 Условно можно выделить 5 этапов: 1. окисляемое вещество (S) образует комплекс с окисленной формой цитохрома Р-450; 2. происходит восстановление этого комплекса электроном от НАДФН; 3. восстановленный комплекс соединяется с молекулой O 2; 4. O 2 в составе комплекса присоединяет ещё один электрон с НАДФН; 5. комплекс распадается с образованием молекулы Н 2 О, окисленной формы цитохрома Р-450 и гидроксилированного субстрата (S-ОН).

В отличие от митохондриальной дыхательной цепи, в монооксигеназной цепи при переносе электронов не происходит аккумулирования энергии в виде АТФ. Микросомальное окисление является свободным окислением. В большинстве случаев гидроксилирование чужеродных веществ снижает их токсичность. Однако могут образоваться продукты с цитотоксическими, мутагенными и канцерогенными свойствами.

Цитохромы Р-450 являются мембранными белками и при исследовании их каталитической активности требуется сложное реконструирование монооксигеназной системы с использованием редокс-партнеров и фосфолипидов. Кроме того, изоферменты цит. Р-450 быстро инактивируются. Электрохимический метода анализа существенно упростил определение активности цит. Р-450. Первые работы, посвященные использованию электрода в качестве донора электронов для катализа цит. Р-450 (CYP 3 А 4): Кузнецов Б. А. , Местечкина Н. М. , Изотов М. В. , Карузина И. И. , Карякин А. В. , Арчаков А. И. (1979) Биохимия, 44, 1569 -1574. Арчаков А. И. , Кузнецов Б. А. , Изотов М. В. , Карузина И. И. (1981) Биофизика, 26, 352 -354.

В настоящее время разработаны электрохимические биосенсорные системы на основе иммобилизованных на электроде цитохромов Р-450. Электрокаталитическая реакция инициируется электронами с электрода. Это исключает необходимость использования редокс-партнеров монооксигеназной системы и восстановительных эквивалентов НАДФН. Определение каталитической активности иммобилизованного цит. Р-450 осуществляется с помощью регистрации каталитического тока, возникающего при внесении в электрохимическую систему субстрата. Регистрарация каталитического тока осуществляется методами вольтамперометрии или амперометрии и позволяет рассчитать многие характеристики ферментативного процесса: константу Михаэлиса-Ментен, электрохимическую каталитическую константу.

Зависимость изменения каталитического тока при амперметрическом титровании цит. Р-450 3 А 4 (CYP 3 А 4) тестостероном при контролируемом напряжении Е = -0, 5 В (vs. Ag/Ag. Cl). На вставке – рассчет элктрохимической Км [тестостерон]. (В. В. Шумянцева и соав. , 2015)

Разработка биосенсоров на основе электрохимических цитохром Р 450 -содержащих систем позволяет выявлять субстраты (ксенобиотики), исследовать эффекты лекарственных препаратов на каталитическую активность конкретных изоформ цитохрома Р 450. Цель – создание сенсорных устройств, пригодных для использования в персонифицированной медицине, проведения экспериментов по изучению влияния лекарственных препаратов на активность СYР в системах электрод/цитохром Р 450.

Преимущества электрохимического метода исследования цитохром Р 450 -монооксигеназной системы 1) электрохимическая система не требует использования дорогостоящих и неустойчивых восстановительных эквивалентов NADPH и NADH, т. к. применяется альтернативный источник электронов – электрод; 2) не требует полного реконструирования монооксигеназной системы (использования всех компонентов микросомальной системы и белков редокс-партнеров каталитического цикла цитохрома Р 450); 3) метод обладает высокой чувствительностью и позволяет использовать минимальное количество дорогостоящего фермента (до 10 -12 мкмоль белка/электрод); 4) электрокатализ и контролируемость ферментативного процесса с помощью электрического тока обладает высокой эффективностью; 5) можно предотвращать инактивацию интактных изоформ Р 450 путем использования различных синтетических модификаторов поверхности электрода.

Методы оценки состояния системы биотранс- формации ксенобиотиков: 1) Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Дает возможность исследовать аналиты в моче, крови, слюне, другом биологическом материале после введения ксенобиотика (лекарственного вещества). Можно проводить кинетический анализ, позволяющий определить период полувыведения тестового препарата, объем кажущегося распределения, клиренс элиминации, исследовать другие параметры. Аналит – это компонент или характеристика образца, подлежащий (ая) измерению. Это понятие включает в себя любой элемент: ион, соединение, вещество, фактор, инфекционный агент, клетку, органеллу, активность (ферментативную, гормональную, иммунологическую) или признак: наличие или отсутствие, концентрацию, активность, интенсивность или другие характеристики, которые необходимо определить. Понятие сформулировано Национальным комитетом по клиническим лабораторным стандартам США (NCCLS, document NRSCL 8 -A). Близко к употребляемому у нас термину «лабораторный показатель» , «параметр» , «тест» и др.

2) ПЦР-ПДРФ анализ полиморфизма и мутантных форм генов цит. Р-450. W; Результаты анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) гена CYP 1 A 2: 1 – маркер молекулярных масс; 2, 4, 6, 7, 8, 10 и 11 – мутантный генотип – M (мутация в сайте рестрикции – рестрикция не происходит); 3 – мутация отсутствует – генотип дикого типа – 5 и 9 – гетерозиготный генотип – имеются все фрагменты – H; 12 – отрицательный контроль.

3) ДНК-чипы Позволяют одновременно определять очень большое количество полиморфизмов в одной пробе. На твердом чипе очень небольшого размера в виде отдельных пятен размещается большое количество олигонуклеотидных зондов, каждый из которых обеспечивает специфическую гибридизацию с нормальными и мутантными аллелями множества различных генов. Перед проведением гибридизации проводят неспецифическое флуоресцентное мечение исследуемой ДНК. В случае связывания ДНК образца с зондом на чипе выявляется флуоресцентный сигнал соответствующего участка чипа [Иванов, Терешин, Щербак, 2010]. Зная, какая аллель отвечает за синтез того или иного изофермента цит. Р-450, можно определить какие ксенобиотики и каким путем будут биотрансформированы.

4) Компьютерные программы для моделирования взаимодействия лигандов с цитохромами Р 450 Для изучения взаимодействия субстрата и фермента используются методы молекулярного докинга и молекулярной динамики. Молекулярный докинг (или молекулярная стыковка) - это метод молекулярного моделирования, который позволяет предсказать наиболее выгодную для образования устойчивого комплекса ориентацию и положение одной молекулы по отношению к другой. При помощи скоринговых функций (англ. score - счет), определяют наиболее энергетически выгодные конформации лиганда в активном центре. Молекулярная динамика - метод, в котором временная эволюция системы взаимодействующих атомов или частиц отслеживается интегрированием их уравнений движения. Играет важную роль (наряду с кристаллографией и ЯМР) в определении структуры белка и уточнении его свойств. Наиболее популярными пакетами программного обеспечения для моделирования динамики биологических молекул являются: AMBER, CHARMM (и коммерческая версия CHARMMm), GROMACS, GROMOS, Lammhs, HOOMD-blue, NAMD.

При описании взаимодействия цит. Р-450 и лигандов оценивается роль пространственных и энергетических факторов, т. к. вклад этих факторов для различных цит. Р 450 отличается. Для исчерпывающего описания взаимодействия низкомолекулярного лиганда и цит. Р-450 in silico и предсказания возможных биотрансформаций необходимо учитывать: § реакционную способность фермента, § структуру активного центра фермента, § расположение и конформацию лиганда в активном центре фермента, § возможность множественных способов связывания субстрата в активном центре фермента (связывание может происходить опосредованно через молекулы воды), § региоспецифичную реакционную способность, присущую самому субстрату (она может меняться в зависимости от конформации, принимаемой субстратом), § аффинность продукта, который должен высвободиться из активного центра фермента.

Р-ция наз. региоспецифичной, если в качестве единств. продукта (в пределах ошибки) образуется один из двух или нескольких возможных регио-изомеров. Региоизомеры – это изомеры, образующиеся в результате преобразования одного из нескольких возможных реакционных центров, имеющихся в молекуле субстрата. Если один изомер лишь преобладает в продуктах р -ции, такая р-ция наз. региоселективной. Напр. , присоединение несимметричного электрофильного НВг к несимметричному стиролу С 6 Н 5 СН=СН 2 происходит региоспецифично: образуется только один из двух возможных продуктов присоединения – С 6 Н 5 СНВr. СН 3, но не С 6 Н 5 СН 2 Вr.

QSAR модели. Количественные взаимоотношения структура-активность (QSAR - англ. сокр. от Quantitative Structure-Activity Relationships) позволяют по описанию структуры химических соединений предсказывать их свойства, в том числе устанавливать взаимодействие с цитохромами низкомолекулярных соединений и их биотрансформацию. Например: 1) для классификации субстратов различных цитохромов применяются: метод построения опорных векторов, метод К-ближайших соседей, метод дерева принятия решений и др. 2) для оценки взаимодействия лигандов, (субстратов и ингибиторов) с активным центром цитохрома используются трехмерные QSAR (3 -D QSAR) методы.

Суперсемейство цит. Р-450 катализирует большое количество реакций, проходящих по разным механизмам, поэтому классические QSAR методы не могут быть применены корректно для веществ, принадлежащих к различным классам. Для каждого отдельного цитохрома, метаболизирующего ксенобиотик, нужно строить специальную QSAR модель с использованием различных дескрипторов и разных математических методов.

Основные цитохромы Р 450, ответственные за метаболизм лекарств в организме человека исследуемые in silico – это подсемейство цит. Р-450 3 А. Цитохром Р 450 ЗА 4 является мембраносвязанным белком, расположен в эндоплазматическом ретикулуме. Молекулярная масса 57299 D, в первичной структуре содержится 502 аминокислотных остатка. Ген CYP 3 A 4 расположен в длинном плече седьмой хромосомы (7 q 22. 1). Подсемейство ЗА – наиболее экспрессируемое в печени и кишечнике. Примерно 2/3 цитохромов печени принадлежат к этому подсемейству. Два цит. Р 450 ЗА 4 и 3 А 5 подробно описаны в литературе. Цит. Р 450 ЗА 5 чаще встречается у подростков, полиморфно экспрессируемый и не индуцируемый глюкокортикоидами, в отличие от ЗА 4. Существует еще одна эмбрионально экспрессируемая изоформа - ЗА 7 (составляет 50 % фетальных цитохромов Р 450).

Цитохром b 5 – гемопротеин, участвует в разнообразных биохимических окислительно-восстановительных реакциях в качестве переносчика электронов. Молекула микросомального цитохрома b 5 состоит из двух доменов - гидрофильного и гидрофобного. Гидрофильный N-концевой участок расположен на поверхности мембраны ЭР, образован аминокислотными остатками с 1 -88, содержит гем, входящий в состав активного центра. Схематичное изображение расположения молекулы цитохрома b 5 в мембране.

Гидрофобный домен цитохрома b 5 заякорен в липидном бислое (ЭПР или митохондриальной), спирализован, образован остатками аминокислот C- конца белковой молекулы (остатки аминокислот 89 -133). С помощью компьютерного моделирования показано, что С -концевой участок молекулы цитохрома b 5 образует петлю и пронизывает липидную мембрану насквозь. Наибольшая гидрофобность наблюдается в средней части петли, которая погружена в мембрану. С-концевая часть молекулы фермента играет важную роль при встраивании в мембрану, ориентации энзима в липидном бислое, обеспечении функциональной активности.

Цитохром b 5 наружной мембраны митохондриий, по сравнению с микросомальным обладает более низким редокспотенциалом, молекула более устойчива к химической и термической денатурации, связь между апопротеином и гемом значительно прочнее. В молекуле цитохрома b 5 митохондрий выявлено два гидрофобных участка. Первый формируют остатки аланина-18, изолейцина-32, лейцина-36 и лейцина-47. Второй – изолейцин 25, фенилаланин-58, лейцин-71 и гем. С использованием мутантных форм молекулы показано, что оба гидрофобных участка имеют большое значение в поддержании стабильности молекулы. При отсутствии или замены в них аминокислотных остатков взаимодействие апопротеина с гемом снижается.

Роль цитохрома b 5 в реакциях, катализируемых изоформами системы цитохрома Р-450. Возможные механизмы стимулирующего влияния цит. b 5 на изоформы цит. Р-450: прямая передача электрона в монооксигеназной реакции, без посредства НАДФ цитохром Р-450 редуктазы; в случае использования второго электрона от цитохрома b 5 в монооксигеназном цикле происходит образование более активных радикалов кислорода, что, в свою очередь, сопровождается более быстрым образованием метаболита;

цит. b 5 взаимодействует с цит. Р-450 с образованием комплекса двух гемопротеинов и последующей передачей двух электронов от НАДФН цитохром Р-450 редуктазы. Это повышает скорость образования активного кислорода и устраняет необходимость повторного взаимодействия цит. Р-450 и НАДФН цитохром Р-450 редуктазы; цит. b 5 может осуществлять аллостерическую стимуляцию цит. Р- 450 без переноса электронов, например на втором этапе каталического цикла; цитохром b 5 может оказывать защитное действие на молекулы терминальной оксигеназы, которое не связано с реакциями окислительно-восстановительного цикла, что предотвращет ее разрушение.

Влияние цит. b 5 на изменение скорости реакции, спектра метаболитов и образование активных форм кислорода в реакциях системы цит. Р-450. в присутствии цит. b 5 скорость метаболизма большинства эндогенных соединений и ксенобиотиков чаще всего повышается; влияние цит. b 5 на биотрансформацию одного и того же соединения, например андростендиона, у разных видов животных неодинаково. У кроликов в присутствии цит b 5 скорость метаболизма стероида цит. Р-450 2 В 5 повышается, а у собак – цит. Р-450 2 В 11 снижается;

цит. b 5 у разных видов (человек и хомячок) может не изменять скорости окисления соединения (нитрозамин) или оказывать стимулирующее действие; наличие цит. b 5 изменяет спектр метаболитов, образующихся при биотринсформации соединения одной и той же изоформой цит. Р-450, например тетрахлорбифенила цит. Р-450 2 В 1; в присутствии цит. b 5 уменьшается образование активных форм кислорода, гиперпродукция которых оказывает негативное действие на жизнедеятельность клеток организма; метаболизм биологически активных соединений (арахидоновая кислота, лейкотриены) происходит только в присутствии цит. b 5.

Влияние цитохрома b 5 на изменение скорости реакции, спектра метаболитов и образование активных форм кислорода в реакциях при участии различных изоформ цит. Р-450 (фрагмент) Изоформа цитохрома Р-450 Субстрат Изменение скорости реакции Р-450 1 А 1 тетрахлорбифенил П Р-450 2 А 1 Р-450 2 В 1 Андростендион П - II - П Р-450 2 В 2 2 -хлор-1, 1 дифлуороэтина тетрахлорбифенил (2, 2", 5, 5"- и 2, 3", 4", 5 -) тетрахлорбифенил (2, 3, 4, 4 -) 9 -антралдегид Р-450 2 В 4 Тетранитрометан Н - II - Aминопирин П Андростендион П Тестостерон не изменяет Образование активных форм кислорода ↓ метанол, 7 -этоксикумарин 9 -антралдегид Изменение спектра метаболитов Р-450 1 А 2 - II - Р-450 2 В 5 - II - ↓ П П изменяется ↓ изменяется П изменяется

НАДН-цитохром b 5 -редуктаза – флавопротеин. Это двухдоменный белок, глобулярный цитозольный домен связывает ФАД, гидрофобный домен (единственный «хвост») закрепляет белок в мембране.

Цитохромы Р450. Структура и функция

Среди ферментов 1-й фазы ведущее место занимает система цитохрома Р450 (P450 или CYP) с точки зрения каталитической активности в отношении огромного числа ксенобиотиков. Наибольшая концентрация цитохрома Р450 обнаруживается в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов (микросомах). Печеночные микросомальные цитохромы Р450 играют важнейшую роль в определении интенсивности и времени действия чужеродных соединений и ключевую - в детоксикации ксенобиотиков, а также в активации их до токсичных и/или канцерогенных метаболитов. Цитохрома Р450-зависимые монооксигеназы – мультиферментная электрон-транспортная система. Все цитохромы Р450 - гемсодержащие белки. Обычно гемовое железо находится в окисленном состоянии (Fe3+). Восстанавливаясь до состояния Fe2+, цитохром Р450 способен связывать лиганды, такие как кислород или монооксид углерода. Комплекс восстановленного цитохрома Р450 с СО имеет максимум поглощения 450 nм, что и явилось основанием для

названия этих ферментов. Основная реакция, которую катализируют цитохромы Р450 – монооксигеназная, в которой один атом кислорода взаимодействует с субстратом (RH), а другой восстанавливается до Н2О. В качестве восстановителя в реакции участвует НАДФН:

RH (субстрат)+О2 + НАДФH + H+ --> ROH (продукт) + Н2О + НАДФ+

Механизм, благодаря которому цитохром получает электрон от НАДФH, зависит от внутриклеточной локализации цитохрома Р450. В ЭПР, где расположено большинство гемопротеидов, участвующих в биотрансформации ксенобиотиков, электрон передается через флавопротеин, называемый НАДФH-Р450 редуктаза. Одна молекула редуктазы может доставлять электроны на несколько различных молекул Р450. В митохондриях, где расположены итохромы Р450, участвующие в биосинтезе стероидных гормонов и метаболизме витамина D, электрон переносится с помощью 2-х белков: ферродоксина или ферродоксин-редуктазы.

На рис. 1 показан каталитический цикл цитохрома Р450. 1-я часть цикла заключается в активации кислорода, 2-я – в окислении субстрата. Схема действия микросомальной монооксигеназной системы впервые была описана Эстабруком с соавт., в настоящее время она подтверждена многими исследователями. Эта схема такова: первая стадия состоит во взаимодействии субстрата с окисленной формой Р450. При связывании Р450 с субстратами

происходит переход гемового железа из низкоспинового в высокоспиновое состояние. Вторая стадия состоит в восстановлении образовавшегося фермент-субстратного комплекса первым электроном, который поступает с НАДФН-специфичной цепи переноса от НАДФН через

флавопротеид I (НАДФН-цитохром Р450 редуктазу). Третья стадия состоит в образовании тройного комплекса: восстановленный цитохрома Р450-субстрат-кислород. Четвертая стадия

представляет собой восстановление тройного комплекса вторым электроном, который, как

полагают, поступает из НАДН-специфичной цепи переноса электронов, состоящей из НАДН-

цитохром b5 редуктазы или флавопротеида II и цитохрома b5 . Пятая стадия состоит из нескольких процессов, включающих внутримолекулярные превращения восстановленного тройного комплекса и его распад с образованием гидроксилированного продукта и воды. На этой стадии цитохром Р450 переходит в исходную окисленную форму.

Цитохромы Р450 катализируют следующие типы реакций: гидроксилирование алифатического или ароматического атома углерода; эпоксидирование двойной связи;

окисление атома (S, N, I) или N-гидроксилирование; перенос окисленной группы;

разрушение эфирной связи; дегидрогенирование. Некоторые реакции, катализируемые

цитохромом Р450, представлены на рис. 2 и 3. Несколько классов реагентов хорошо

гидроксилируется последний углерод в цепи, так называемое омега- гидроксилирование. Так

же бывает внутреннее гидроксилирование в нескольких позициях (позиции -1,- 2).

Это приводит к множеству различных вариантов продуктов даже с таким простым алканом, как гексан. Заметим, что циклические углеводороды тоже подвергаются гидроксилированию. В реакции гидроксилирования сначала образуется полуацеталь, который потом превращается в спирт и альдегид. При окислении алкенов цитохромом Р450 образуются двуатомные окиси. Они отличаются по своей стабильности и могут являться высоко реакционноспособными. Например, винилхлорид метаболически переходит в окись, которая затем превращается в хлорацетальдегид – мутаген, действующий непосредственно на ДНК. Эти исследования привели к запрету на использование винилхлорида в распылителях. Винильная группа стерина (винилбензол) известна своими канцерогенными свойствами, но организм человека способен нейтрализовать его, переводя окись с помощью фермента эпоксигидролазы в диол. Но эпоксигидролаза помогает не всегда. Например, цитохром Р450 синтезирует эпоксид Афлотоксина В1 in vivо. Это соединение – высоко реакционноспособный электрофил, не стабилен и быстро формирует аддукт с ДНК. К тому же диол, образующийся из эпоксида, так же нестабилен и высоко реакционноспособен. Окисление ароматических соединений цитохромом Р450 так же дает эпоксиды, но они быстро переходят в фенол. В результате гидроксилирования бензола, полученный фенол может опять гидроксилироваться, переходя в катехол или гидрохинон. Заметим, что катехол и гидрохинон могут реагировать с кислородом, подавляя аналогичные реакции с хинонами и супероксидами, которые являются токсинами. Такое известное соединение как 2,3,7,8-тетрахлордибензолдиоксин (ТХДД) не подвержен гидроксилированию и устойчив (период полураспада в организме человека – год и более).